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基于Rorα/Bmal1信号轴探讨半夏秫米汤对慢性失眠大鼠睡眠稳态的影响  PDF

  • 张艳
  • 王书君
  • 尚春光
  • 张喆
  • 刘西建 ✉
山东中医药大学中医学院， 山东 济南 250355

中图分类号： R740

最近更新：2024-10-12

DOI： 10.3969/j.issn.1005-8982.2024.15.006

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EN 引
目录contents

摘要

目的

探讨“引阳入阴”代表性方剂半夏秫米汤对慢性失眠（CI）大鼠生物钟基因Rorα/Bmal1信号轴的影响。

方法

SPF级大鼠36只，随机分为空白组、模型组、半夏秫米汤低剂量组（BXSM-L组）、半夏秫米汤中剂量组（BXSM-M组）、半夏秫米汤高剂量组（BXSM-H组）、地西泮组（DZ组），每组6只。除空白组外，其余各组均采用小平台水环境法复制CI模型大鼠。BXSM-L组、BXSM-M组、BXSM-H组大鼠分别灌胃4.69、9.38、18.75 g/kg半夏秫米汤水煎剂，DZ组大鼠灌胃0.52 mg/kg地西泮水溶液，空白组和模型组大鼠均给予等体积生理盐水灌胃，连续14 d。给药结束后，用16道生理记录仪监测脑电波，实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting、免疫组织化学法分别检测视交叉上核（SCN）、大脑皮层（CC）的Rorα和Bmal1基因及蛋白表达，酶联免疫吸附试验检测脑干与血清中γ氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）含量。

结果

模型复制成功后的大鼠皮毛暗淡无光泽，精神萎靡，易激惹，对周围声、光刺激敏感，昼夜节律消失。空白组α波、β波频率均低于造模组（除空白组外其余各组统称为造模组）、δ波频率高于造模组（P <0.05）。空白组β波波幅低于造模组，δ波波幅高于造模组（P <0.05）。模型组的α波、δ波频率较空白组均下降（P <0.05），β波频率较空白组上升（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组α波频率较模型组均上升（P <0.05），β波频率较模型组均下降（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组δ波频率较模型组均上升（P <0.05）。模型组的β波波幅较空白组上升（P <0.05），δ波波幅较空白组下降（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组β波波幅较模型组均下降（P <0.05），δ波幅较模型组均上升（P <0.05），BXSM-L组α波波幅较模型组上升（P <0.05）。模型组血清、脑干Glu、GABA含量较空白组均升高（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组血清Glu含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组脑干Glu含量较模型组均降低（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组血清GABA较模型组均降低（P <0.05），BXSM-L组、BXSM-H组及DZ组脑干GABA含量较模型组均降低（P <0.05）。模型组血清、脑干NE、DA含量较空白组均升高（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组血清、脑干NE含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组血清DA含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-H组和DZ组脑干DA较模型组降低（P <0.05）。模型组SCN、CC的Rorα与Bmal1基因和蛋白相对表达量较空白组下降（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组SCN、CC的Rorα与Bmal1基因和蛋白相对表达量较模型组均上升（P <0.05）。

结论

首次从生物钟基因角度揭示了半夏秫米汤“引阳入阴”改善CI的机制，可能是通过上调Rorα/Bmal1信号轴调控睡眠稳态。

慢性失眠（chronic insomnia, CI）是最常见的睡眠-觉醒紊乱，以患者长期对睡眠数量或质量不满意为特征[

1]，在中国发病率约为15%[2]，是重要的脑病，与认知功能、心理健康及生活质量关系密切[3]。

睡眠稳态是指睡眠剥夺后出现的睡眠时间更长、睡眠程度更深、δ振荡（0.5～4.0 Hz）功率增加的现象[

4]，被认为是慢性失眠的机制之一[5]。而时钟基因能调节睡眠稳态[6]，如生物钟基因Per2可以影响睡眠稳态，Per2变异型的携带者慢波睡眠时间比非携带者短22%或少20 min[7]。睡眠相位延迟障碍患者出现的晚睡和/或碎片睡眠与生物钟基因Cry1编码变异有关[8]。生物钟基因Cry1和Cry2双重敲除的小鼠出现更多非快速眼动睡眠和更高的睡眠巩固[9]。核心生物钟基因Bmal1敲除后的小鼠总睡眠时间延长，睡眠破碎和脑电图（Electroencephalogram, EEG）的δ功率增加，对急性睡眠剥夺的补偿反应减弱[10]。时钟控制基因Rorα能调节睡眠持续时间[11-12]。因此，通过干预生物钟基因调节睡眠稳态是本研究的重点。

中医药治疗失眠历史悠久，疗效显著且安全性高，其通过调节生物钟基因[

13-16]表达而改善失眠。最早记载于《黄帝内经》的半夏秫米汤，由半夏和秫米二药组成，是“引阳入阴”安神，治疗失眠的先河之方。本团队前期研究表明，该方能够减少小鼠自主活动，缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间[17]，并抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴，调节炎症因子、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric, GABA）、多巴胺（Dopamine, DA）、去甲肾上腺素（Norepinephrine, NE），改善失眠[18]。但截至目前，尚未见基于生物钟基因调控睡眠稳态探讨半夏秫米汤改善CI的报道。本研究首次基于Rorα/Bmal1信号轴探讨半夏秫米汤对CI大鼠睡眠稳态的影响，以期揭示其作用机制，为中医药防治失眠提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1　实验动物

SPF级Wistar大鼠，体重（200±20 g），6周龄，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物繁育有限公司[合格证号：110011201110886725；实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006；实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）20170022]，于山东中医药大学SPF级动物房饲养。本实验经山东中医药大学伦理委员会批准（No：SDUTCM20201216001）。

1.2　主要药物、试剂及仪器

1.2.1　主要药物

半夏秫米汤由生半夏、秫米组成。生半夏购自安徽精诚本草中药饮片有限公司，秫米购自亳州市亿弘堂有限公司。称取生半夏60 g、秫米120 g，4剂，共720 g，分批浸泡于10倍体积的冷水中，加热煮沸1 h，过滤冷却后，在低温、低压下浓缩成2 g/mL液体，在4 ℃的冰箱中保存备用。戊巴比妥钠（20190816，北京市普博斯生物科技有限公司）；地西泮片（H37023039，山东省信宜制药有限公司）。

1.2.2　主要试剂

大鼠GABA、Glu、NE、DA酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（江苏省晶美生物科技有限公司，190708KE11、190708KE17、190708KE14、190708KE15），RIPA快速裂解液（Solarbio科技有限公司，R0020），总RNA提取试剂（TRIzon法）（康为世纪科技有限公司，CW0580），总蛋白定量试剂盒（BCA法）（碧云天生物技术有限公司，P0012），逆转录试剂盒（奕杉生物科技有限公司，RT001），PBS缓冲溶液（即用型干粉，biosharp，BL502B），重组Anti-RORA抗体（EPR23719-18）（英国Abcam公司，ab256799），重组Anti-Bmal1抗体（EPR23696-22）（英国Abcam公司，ab230822），GAPDH Polyclonal Antibody（武汉三鹰生物技术有限公司，10494-1-AP），DAB显色试剂盒（山东思科捷生物技术有限公司，EE0017）。

1.2.3　主要仪器

睡眠剥夺箱（自制），16道生理记录仪（美国Copyright公司，MP160），脑立体定位仪（瑞沃德生命科技，68026），台式冷冻离心机（Eppendorf 中国有限公司，5424R），全波长酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，BioTek Cytation 5），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（德国罗氏诊断有限公司，Roche Light Cycler 480Ⅱ），电泳仪（Bio-Rad有限公司，PowerPac HC），多色荧光成像系统（思拓凡生物科技有限公司，Amersharm Ima），石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司，YB-6LF），全自动脱水机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司，ZT-12M），包埋冷冻台（常州派斯杰医疗设备有限公司，BM450），石蜡切片机（德国，LeicaRM2255），正置荧光显微镜（德国Carl Zeiss AG，Axio Examiner.A1）。

1.3　实验方法

1.3.1　动物分组及CI模型复制

按照随机数字表法将36只大鼠分为空白组、模型组、半夏秫米汤低剂量组（BXSM-L组）、半夏秫米汤中剂量组（BXSM-M组）、半夏秫米汤高剂量组（BXSM-H组）和地西泮组（DZ组）。除空白组大鼠外，其余各组（以下统称为造模组）均采用小平台水环境法[

13-14]，每日12:00～次日8:00剥夺睡眠，连续21 d，复制CI大鼠模型。

1.3.2　治疗方法

模型复制成功后，BXSM-L组、BXSM-M组、BXSM-H组大鼠分别灌胃4.69、9.38、18.75 g/kg半夏秫米汤水煎剂，DZ组大鼠灌胃0.52 mg/kg地西泮水溶液，空白组、模型组大鼠均给予等体积生理盐水灌胃，1 次/d，连续14 d。

1.3.3　脑电极、肌电极安装及脑电、肌电采集与分析

参考文献[

19]安装脑电极。采用50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射将大鼠麻醉后，固定于脑立体定位仪中，脱去头部毛后消毒，剪去皮肤，充分暴露颅骨，剥膜后，使用不锈钢螺丝钉（直径2 mm）作为皮层电极分别置入左侧枕叶（AP-4.80，ML-3.0）、右侧枕叶（AP-4.80，ML+3.0）、额骨正中（ML-0.0，AP+5）。额骨正中为接地电极，牙科水泥固定微型插座。之后每天腹腔注射青霉素4万单位，1 次/d，连续3 d，然后恢复7 d，行脑电描记。用长度约10 cm的漆包线做肌电极，两端去掉1 cm绝缘层，采用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠后，将肌电极置入大鼠颈后双侧深部肌肉内即完成安装。在正式描记前，适应性训练1.5 h。分别于模型复制成功后、给药后第14天上午9：00～12：00，在电磁屏蔽室内，用16道生理记录仪描记脑电3 h，再采用Acqknowledge软件分析。

1.3.4　标本采集

末次给药后，各组大鼠禁食、禁水24 h，异氟烷麻醉，于腹主动脉取血，室温静置30 min，4 000 r/min离心10 min，获取上清液。取血后迅速断头取脑，冰上分离视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）、大脑皮层（cerebral cortex, CC）、脑干后，置入-80 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.3.5　ELISA检测大鼠脑干、血清中GABA、Glu、NE、DA含量

取脑干、血清，采用ELISA检测GABA、Glu、NE、DA含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6　qRT-PCR检测大鼠SCN、CC的Rorα和Bmal1 基因相对表达量

每组取3只大鼠适量SCN、CC，TRIzol法提取总 RNA，之后逆转录，行qRT-PCR（SYBR Green法）。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s；50 ℃退火30 s；60 ℃延伸30 s；共45个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因SCN、CC和内参基因GAPDH的相对表达量。引物序列见表1。

表1  qRT-PCR引物序列
基因引物序列长度/bp
Rorα 正向： 5'-ATAGGACCAGCAGAAACCGC-3' 212
反向： 5'-GATGTTGTAGGTGGGCGTCA-3'
Bmal1 正向： 5'-CCACAGCACAGGCTACTTGA-3' 160
反向： 5'-CACCCGTATTTCCCCGTTCA-3'
GAPDH 正向： 5'-TCTCTGCTCCTCCCTGTTCT-3' 95
反向： 5'-ATCCGTTCACACCGACCTTC-3'

1.3.7　Western blotting检测大鼠SCN、CC的Rorα和Bmal1蛋白相对表达量

每组取3只大鼠适量SCN、CC，分别加入裂解液并匀浆，4 ℃、14 000 r/min离心15 min，测定总蛋白的浓度，调整各组样品总蛋白浓度一致，高温变性后，电泳，转膜，封闭，加一抗，GAPDH按1∶20 000稀释，Rorα、Bmal1按1∶1 500稀释，加二抗按1∶20 000稀释，孵育，ECL显色，用Image J软件分析各组大鼠SCN、CC的Rorα和Bmal1蛋白相对表达量。

1.3.8　免疫组织化学检测大鼠SCN的Rorα和Bmal1蛋白表达

将大鼠SCN从4%多聚甲醛中取出后，用石蜡包埋并制成切片，依次脱蜡水化、抗原修复，室温下封闭10 min，加入一抗（Rorα 1∶800，Bmal1 1∶1 000）4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，加入二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗3次，依次DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片。显微镜下，在每张切片中随机取5个高倍（×400）视野进行拍照，AD值（AD= IOD/面积）采用Image J软件分析。

1.4　统计学方法

数据分析采用SPSS 26.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用t检验或方差分析，组间进一步两两比较用LSD-t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　模型复制成功后大鼠的状态

模型复制成功后的大鼠皮毛暗淡无光泽，精神萎靡，易激惹，对周围声、光刺激敏感，昼夜节律消失。

2.2　空白组与造模组大鼠睡眠潜伏期、睡眠持续时间比较

空白组与造模组睡眠潜伏期和睡眠持续时间比较，经t检验，差异均有统计学意义（P <0.05）；空白组睡眠潜伏期短于造模组，睡眠持续时间长于造模组。见表2。

表2  空白组与造模组大鼠睡眠潜伏期、睡眠持续时间比较（min， x±s）
组别n睡眠潜伏期睡眠持续时间
空白组 6 19.25±1.71 70.00±3.16
造模组 30 32.20±1.77† 54.15±2.46†
t 值 16.441 13.764
P 值 0.000 0.000

注 ：   †与空白组比较，P <0.05。

2.3　空白组与造模组大鼠脑电波频率、波幅的比较

空白组与造模组脑电波频率（α波、β波、δ波）比较，经t检验，差异均有统计学意义（P <0.05）；空白组α波、β波频率低于造模组、δ波频率高于造模组。空白组与造模组脑θ波比较，经t检验，差异无统计学意义（P >0.05）。空白组与造模组脑电波（β波、δ波）波幅比较，经t检验，差异均有统计学意义（P <0.05）；空白组β波波幅低于造模组，δ波波幅高于造模组。空白组与造模组脑电波（α波、θ波）波幅比较，经t检验，差异均无统计学意义（P >0.05）。见表3、4。

表3  模型复制后大鼠脑电波频率的比较 ( Hz，x±s )
组别nα波β波θ波δ波
空白组 6 10.25±0.27 20.09±0.29 6.68±0.39 3.57±0.36
造模组 30 11.63±0.57† 27.05±0.75† 6.68±0.24 1.75±0.15†
t 值 5.752 22.184 0.000 20.809
P 值 0.000 0.000 1.000 0.000

注 ：   †与空白组比较， P <0.05。

表4  模型复制后大鼠脑电波波幅的比较 ( uV，x±s )
组别nα波β波θ波δ波
空白组 6 14.84±0.46 20.47±0.66 20.56±0.56 40.08±0.86
造模组 30 15.07±0.85 25.63±0.49† 20.73±0.41 34.43±0.50†
t 值 0.639 22.253 0.873 22.264
P值 0.527 0.000 0.389 0.000

注 ：   †与空白组比较，P <0.05。

2.4　半夏秫米汤对大鼠脑电波频率的影响

给药14 d后，各组大鼠α波、β波、θ波、δ波频率比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，模型组的α波频率、δ波频率较空白组均下降（P <0.05），β波频率较空白组上升（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组α波频率较模型组均上升（P <0.05），β波频率均下降（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组δ波频率较模型组均上升（P <0.05）。见表5。

表5  给药14 d后各组大鼠脑电波频率的比较　（n =6， Hz， x±s）
组别α波β波θ波δ波
空白组 13.64±1.30 21.74±0.47 6.59±0.37 3.84±0.25
模型组 11.83±0.90① 27.20±0.62① 6.75±0.33 2.06±0.38①
BXSM-L组 14.36±0.51② 23.51±0.47② 7.07±0.31 2.54±0.37
BXSM-M组 15.77±0.10② 22.61±0.47② 7.43±0.93 3.52±0.31②
BXSM-H组 16.49±0.27② 20.46±1.10② 7.54±0.32 4.07±0.85②
DZ组 15.80±0.08② 22.47±0.40② 7.03±0.67 3.53±0.30②
F 值 37.951 78.557 2.805 17.772
P 值 0.000 0.000 0.034 0.000

注 ：   ①与空白组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

2.5　半夏秫米汤对大鼠脑电波波幅的影响

给药14 d后，各组大鼠α波、β波、θ波、δ波波幅比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，模型组的β波波幅较空白组上升（P <0.05），δ波波幅较空白组下降（P <0.05），模型组的α、θ波波幅与空白组比较，差异均无统计学意义（P >0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组β波波幅较模型组均下降（P <0.05），δ波幅较模型组均上升（P <0.05），BXSM-L组α波波幅较模型组上升（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组α波波幅与模型组比较，差异均无统计学意义（P >0.05）；半夏秫米汤不同剂量组及DZ组θ波波幅与模型组比较，差异均无统计学意义（P >0.05）。见表6。

表6  给药14 d后各组大鼠脑电波波幅的比较　（n =6， uV， x±s）
组别α波β波θ波δ波
空白组 15.03±0.25 21.42±0.42 20.12±1.09 40.42±0.14
模型组 14.83±0.35 27.82±0.67① 20.43±0.24 33.61±4.48①
BXSM-L组 19.08±0.36② 22.99±0.28② 19.30±0.26 36.47±0.46②
BXSM-M组 20.84±0.63 22.76±0.32② 19.52±0.94 38.38±0.19②
BXSM-H组 23.78±0.44 20.68±0.30② 20.49±0.27 40.64±0.41②
DZ组 20.15±0.15 22.13±1.08② 21.10±0.65 38.97±0.25②
F 值 471.141 113.128 5.927 12.386
P 值 0.000 0.000 0.001 0.000

注 ：   ①与空白组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

2.6　各组大鼠血清、脑干Glu、GABA含量的比较

各组大鼠血清、脑干Glu、GABA含量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，模型组血清、脑干Glu、GABA含量较空白组均升高（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组血清Glu含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组脑干Glu含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-L组脑干Glu含量与模型组比较，差异无统计学意义（P >0.05）。半夏秫米汤不同剂量组及DZ组血清GABA较模型组均降低（P <0.05），BXSM-L组、BXSM-H组及DZ组脑干GABA含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-M组脑干GABA含量与模型组比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见表7。

表7  各组大鼠血清、脑干Glu、GABA含量的比较　（n =6， μmol/L， x±s）
组别血清Glu脑干Glu血清GABA脑干GABA
空白组 10.23±0.22 10.98±1.31 25.55±1.33 26.86±4.55
模型组 13.50±0.87① 13.28±0.53① 33.49±2.13① 34.35±1.57①
BXSM-L组 11.20±0.74② 12.36±0.76 28.66±1.53② 29.57±1.57②
BXSM-M组 11.55±0.66② 11.53±0.62② 28.01±1.34② 30.58±0.51
BXSM-H组 12.21±1.01② 11.35±0.59② 29.98±1.43② 27.05±1.11②
DZ组 12.02±0.59② 11.21±1.32② 28.68±1.82② 28.14±2.18②
F 值 13.668 5.416 15.584 8.918
P 值 0.000 0.001 0.000 0.000

注 ：   ①与空白组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

2.7　各组大鼠血清、脑干NE、DA含量的比较

各组大鼠血清、脑干NE、DA含量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，模型组血清、脑干NE、DA含量较空白组均升高（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组血清NE含量较模型组均降低（P <0.05），半夏秫米汤不同剂量组及DZ组脑干NE含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组血清DA含量较模型组均降低（P <0.05），BXSM-L组血清DA含量与模型组比较，差异无统计学意义（P >0.05），BXSM-H组及DZ组脑干DA较模型组降低（P <0.05），BXSM-L组、BXSM-M组脑干DA与模型组比较，差异均无统计学意义（P >0.05）。见表8。

表8  各组大鼠血清、脑干NE、DA含量的比较　（n =6， ng/L， x±s）
组别血清NE脑干NE血清DA脑干DA
空白组 192.64±11.15 193.86±26.70 71.37±6.43 74.19±11.00
模型组 276.40±11.21① 247.81±15.78① 88.37±4.92① 95.76±4.21①
BXSM-L组 223.43±11.49② 220.50±12.25② 81.42±3.85 87.52±1.41
BXSM-M组 225.17±14.23② 208.66±12.23② 78.81±5.81② 84.71±5.00
BXSM-H组 238.12±12.59② 209.17±6.68② 79.35±4.91② 78.88±5.31②
DZ组 220.87±9.05② 210.68±19.41② 68.64±10.51② 77.81±7.31②
F 值 32.841 7.044 7.328 8.953
P 值 0.000 0.002 0.000 0.000

注 ：   ①与空白组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

2.8　各组大鼠SCN、CC的Rorα、Bmal1基因相对表达量的比较

各组大鼠SCN、CC的Rorα和Bmal1 mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，模型组SCN、CC的Rorα和Bmal1 mRNA相对表达量较空白组下降（P <0.05）；BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组SCN、CC的Rorα和Bmal1 mRNA相对表达量较模型组均上升（P <0.05），BXSM-L组与模型组比较，差异均无统计学意义（P >0.05）。见表9。

表9  各组大鼠SCN、CC的Rorα和Bmal基因相对表达量比较 ( n =3， x±s )
组别SCNCC
Rorαm RNABmal1 mRNARorα mRNABmal1 mRNA
空白组 1.09±0.12 1.14±0.31 1.56±0.05 1.51±0.11
模型组 0.39±0.09① 0.37±0.01① 1.00±0.14① 1.04±0.21①
BXSM-L组 0.75±0.16 0.86±0.42 1.33±0.08 1.25±0.18
BXSM-M组 1.10±0.38② 0.98±0.28② 1.61±0.11② 1.54±0.15②
BXSM-H组 1.27±0.50② 1.12±0.34② 1.57±0.10② 1.54±0.10②
DZ组 1.24±0.39② 1.18±0.22② 1.69±0.10② 1.60±0.20②
F 值 3.448 3.245 22.293 5.415
P 值 0.037 0.044 0.000 0.008

注 ：   ①与空白组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

2.9　各组大鼠SCN和CC的Rorα和Bmal1蛋白相对表达量的比较

空白组、模型组、BXSM-L组、BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组SCN与CC的Rorα和Bmal1蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，模型组SCN与CC的Rorα和Bmal1蛋白相对表达量较空白组均降低（P <0.05）；BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组SCN中Rorα和Bmal1蛋白相对表达量较模型组均上升（P <0.05），BXSM-L组与模型组比较，差异均无统计学意义（P >0.05）；半夏秫米汤不同剂量组及DZ组CC的Rorα和Bmal1蛋白相对表达量较模型组均上升（P <0.05）。见表10和图1。

表10  各组大鼠SCN、CC的Rorα和Bmal1蛋白相对表达量比较 ( n =3， x±s )
组别SCNCC
Rorα蛋白Bmal1蛋白Rorα蛋白Bmal1蛋白
空白组 1.05±0.08 1.20±0.11 1.22±0.10 1.27±0.02
模型组 0.35±0.12① 0.66±0.13① 0.95±0.04① 0.75±0.05①
BXSM-L组 0.78±0.04 0.96±0.21 1.13±0.09② 1.05±0.02②
BXSM-M组 0.99±0.12② 1.31±0.22② 1.30±0.06② 1.23±0.04②
BXSM-H组 1.21±0.04② 1.46±0.35② 1.22±0.04② 1.27±0.01②
DZ组 1.02±0.15② 1.35±0.14② 1.11±0.11② 1.18±0.12②
F 值 27.074 6.270 6.980 63.345
P 值 0.000 0.004 0.003 0.000

注 ：   ①与空白组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

图1  各组大鼠SCN、CC的Rorα和Bmal1的蛋白表达

1：模型组； 2：空白组； 3：BXSM-L组； 4：BXSM-M组； 5：BXSM-H组； 6：DZ组。

免疫组织化学结果见图2。检测大鼠SCN中Rorα和Bmal1的AOD值并进行比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，模型组SCN与CC的Rorα和Bmal1蛋白表达较空白组减少（P <0.05）；BXSM-M组、BXSM-H组及DZ组Rorα蛋白表达较模型组增加（P <0.05）；BXSM-L组Rorα蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义（P >0.05）；半夏秫米汤不同剂量组及DZ组Bmal1蛋白表达较模型组均增加（P <0.05）。见表11。

图2  各组大鼠SCN的Rorα和Bmal1的蛋白表达　（免疫组织化学×400）

表11  各组大鼠SCN的Rorα和Bmal1的AOD值比较 ( n =3， x±s )
组别RorαBmal1
空白组 0.39±0.01 0.40±0.02
模型组 0.19±0.01① 0.19±0.01①
BXSM-L组 0.26±0.01 0.27±0.03②
BXSM-M组 0.38±0.02② 0.37±0.01②
BXSM-H组 0.41±0.03② 0.39±0.01②
DZ组 0.40±0.01② 0.36±0.01②
F 值 87.847 52.070
P 值 0.000 0.000

注 ：   ①与空白组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

3 讨论

半夏秫米汤为“引阳入阴”的代表性方剂，被称为“失眠第一方”。《灵枢·邪客》谓：“补其不足，泻其有余，调其虚实，以通其道而去其邪……，饮以半夏汤一剂，阴阳已通，其卧立至。”方中半夏生当夏半，正值阴阳交换之时，故能引阳入阴而安神，原方剂量为1合，折合现代剂量约60 g。秫米，多数医家认为是高粱[

20]，如近代名医张锡纯曾指出“秫米即芦稷之米”。高粱能通阴补虚而安神[21]，原方用量为1 L，折合成现代剂量约120 g。二药合用，引阳入阴安神，张景岳曰此方“治久病不寐者神效。”但其作用机制仍不十分明确，本文从生物钟基因Rorα/Bmal1信号轴探讨了该方对慢性失眠大鼠睡眠稳态的影响。

睡眠稳态被认为是控制睡眠质量和睡眠持续时间的主要机制，也是慢性失眠的病理机制之一[

5]。睡眠稳态的调节是由睡眠压力或清醒时间驱动的，而睡眠压力会随着清醒时间的增加而增加。虽然睡眠压力难以量化，但脑电图特征已被验证为睡眠稳态增加的可靠标志物[9]。而脑电图主要包括α波、β波、θ波、δ波，其中α波常于机体安静、觉醒、放松的状态下出现；β波常于忧虑、紧张或狂躁时出现，代表着大脑皮层兴奋性的提高。而高幅度的慢波δ波或θ波则于人体困倦时出现，是大脑处于抑制状态时电活动的主要表现。而且θ波和α波功率也随觉醒时间的延长而增加[9]。睡眠稳态则一般将δ波和β波作为标志物[22]，δ功率视作睡眠压力的衡量指标，反映睡眠深度[23]。本实验采用小平台水环境法连续21 d复制CI大鼠模型，结果显示模型复制后大鼠动物行为学变化符合失眠特点，与空白组相比，复制后的大鼠睡眠潜伏期显著延长，睡眠持续时间显著缩短，β波频率、波幅增加，δ波频率、波幅减少；α波频率在模型初期升高，可能与觉醒状态增加有关，给药后减少，则可能是与安静的放松状态减少有关，而给予半夏秫米汤后，不同的剂量能够降低β波频率、波幅，升高δ波频率、波幅，升高α波频率、波幅，提示半夏秫米汤能一定程度改善慢性失眠大鼠的睡眠稳态，提高睡眠深度，改善忧虑、紧张状态，并尤以原方剂量较佳。

生物钟基因包括核心生物钟基因（Bmal1、Clock、Cry1、Cry2、Cry3、Per1、Per2和Per3）和时钟控制基因（Nr1d1、Nr1d2、Rorα、Rorβ和Rorγ），Cry和Per蛋白复合物抑制Clock-Bmal1活性，从而抑制其自身的转录。Cry和Per蛋白被降解，从而恢复Bmal1时钟活性。Clock/Bmal1激活转录因子REV-Erbα/β和Rorα/β/γ蛋白。而Rora蛋白则是Bmal1转录的激活剂。研究表明，生物钟基因除了控制昼夜节律，还能调节睡眠稳态，包括睡眠长度和睡眠深度[

6]。时钟控制基因Rorα调节睡眠潜伏期及持续时间[11-12]。核心生物钟基因Bmal1调节睡眠时间，敲除后总睡眠时间延长，睡眠破碎和δ功率增加[10]。昼夜节律起搏器-SCN通过投射神经元调节睡眠-觉醒系统。下丘脑结节核中的组胺能神经元、中缝正中核的多巴胺能神经元，以及蓝斑核的去甲肾上腺素能神经元均是觉醒系统组成部分[24]，前额叶皮质通过与纹状体、下丘脑形成环路共同调节睡眠-觉醒状态。该系统的中枢神经递质DA和NE促进觉醒[25-26]，与焦虑、抑郁有关[27-28]。有证据表明，NE在调节觉醒状态和脑电图δ功率中起关键作用[29]，DA对睡眠稳态有一定作用[30]。GABA作为主要的抑制性神经递质，诱导、维持睡眠[31-32]，抗焦虑、抗抑郁，同时能调节睡眠稳态，如GABA（A）激动剂可增加大鼠非快速眼动睡眠时间、慢波睡眠时间和脑电δ波[33]。Glu是主要的兴奋性神经递质，能促进觉醒，中枢神经系统中的Glu可以由脑组织通过血脑屏障进入血液循环，因此，血液循环系统中的Glu主要来源于脑组织中的Glu，由此可以认为血液Glu浓度一定程度上能够反映中枢神经系统细胞外Glu水平。Glu也具有调节睡眠稳态作用，研究报道mGlu2/3受体激活剂能降低海马θ振荡的频率，增加δ波功率，降低β波功率[34]。本研究中模型大鼠视交叉上核、大脑皮层Rorα、Bmal1 mRNA与蛋白表达下调，血清、脑干NE、DA、Glu、GABA升高，而半夏秫米汤不同剂量能不同程度地逆转上述现象，与酸枣仁汤[13，35]研究结果相似，但本研究首次对视交叉上核、大脑皮层的Rorα/Bmal1影响进行了研究。提示半夏秫米汤可能通过上调Rorα/Bmal1信号轴，进而调节NE、DA、Glu、GABA水平达到降低β波频率、波幅，增加α、δ波频率、波幅从而增加睡眠深度，改善睡眠稳态。而GABA在模型复制后升高，可能与睡眠剥夺后引起的反馈性调节有关，其具体的机制仍需进一步研究探讨。

综上所述，本研究认为半夏秫米汤“引阳入阴”安神改善睡眠稳态，可能是通过上调生物钟基因Rorα/Bmal1信号轴从而调控睡眠-觉醒系统中枢神经递质达到的。

参 考 文 献

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