摘要
收集20例确诊为AAD的组织标本作为AAD组，20例无主动脉病变的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的组织标本作为NC组，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blotting检测检测miR-183、MMP-9蛋白相对表达量。将人主动脉平滑肌细胞（HASMC）分为3组：Mimic组、Inhibitor组和对照组；Mimic组用miRNA-183 mimic转染HASMC；Inhibitor组用miRNA-183 inhibitor转染HASMC，对照组未做处理。采用qRT-PCR和Western blotting检测miR-183、MMP-9 mRNA、MMP-9蛋白及其底物弹性蛋白（Elastin）的表达。
AAD组miRNA-183相对表达量低于NC组（P <0.05），而MMP-9蛋白相对表达量高于NC组（P <0.05）。与对照组比较，Mimic组miRNA-183、Elastin升高（P <0.05），MMP-9 mRNA和蛋白降低（P <0.05）；Inhibitor组miRNA-183、Elastin降低（P <0.05），MMP-9 mRNA和蛋白升高（P <0.05）。
急性主动脉夹层（acute aortic dissection, AAD）是一种急性心血管疾病，发病机制与主动脉中膜细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的降解有关。有研究报道，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）通过调节ECM重塑，参与胸主动脉瘤或胸主动脉夹层的发病，其中MMP-9作为MMPs家族的一员，具有很强的降解弹性蛋白和胶原蛋白的能力，可导致主动脉中层的弹性蛋白和胶原蛋白大量崩解，诱导平滑肌细胞凋亡，从而促进主动脉夹层的形
选取2017年8月—2018年8月在中国医科大学附属第一医院就诊的AAD患者。纳入标准：①经影像学诊断为AAD；②签字接受主动脉手术治疗的患者；③临床资料完整。排除标准：①马方综合征；②大动脉炎；③梅毒性主动脉夹层；④主动脉粥样硬化。根据纳入和排除标准，共纳入20例AAD患者作为AAD组，其中男性14例，女性6例；年龄32～69岁，平均（52.2±10.6）岁；选取20例同期本院无主动脉病变的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者为NC组，其中男性12例，女性8例；年龄33～65岁，平均（54.8±9.0）岁。AAD组标本取自升主动脉段破口周围的组织，NC组标本取自在升主动脉处打孔的废弃组织，组织离体后，立即置于液氮中速冻，置入-80℃冰箱冷冻保存备检。本研究经医院医学伦理委员会批准（No：AF-SOP-07-1.1-01）。
人主动脉平滑肌细胞（HASMC）（美国ATCC公司），引物、miRNA-183 mimic、miRNA-183 inhibitor及RNAifectin™ Transfection Reagent（加拿大ABM公司），RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗人MMP-9、Elastin抗体（英国Abcom公司）。ABI 7500实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（美国ABI公司）。
将细胞快速解冻复苏，培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37%、5%二氧化碳培养箱中。取增殖状态良好的细胞进行消化、离心、计数，按1×1
采用TRIzol法提取组织及细胞中总RNA，检测RNA浓度及纯度，按照说明书进行逆转录，按比例加入Master Mix、正反向引物、RNAase-free水，共20 μL，在qRT-PCR仪上反应，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s、60℃退火34 s，共40个循环，采用
使用RIPA裂解液提取组织和细胞中总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，配制SDS-PAGE凝胶，每个孔道加入等量蛋白，电泳分离，标准湿式转膜，用PVDF膜封闭于含5%脱脂牛奶中，水平摇床上室温封闭1.5～2.0 h，一抗4℃孵育过夜（MMP-9稀释比例1∶3 000，Elastin稀释比例1∶300），二抗室温孵育2 h，使用ECL发光液在暗室中发光显色。Image J分析条带灰度值，以GAPDH为内参，以各目的蛋白与内参蛋白的比值作为组织中MMP-9蛋白，以及细胞中MMP-9、Elastin蛋白相对表达量。
AAD组与NC组年龄、性别构成比较，差异无统计学意义（P >0.05），具有可比性。见
| 组别 | 年龄/（岁， x±s） | 男/女/例 |
|---|---|---|
| AAD组 | 52.2±10.6 | 14/6 |
| NC组 | 54.8±9.0 | 12/8 |
|
t/ | 0.832 | 0.440 |
| P 值 | 0.411 | 0.507 |
两组miRNA-183、MMP-9蛋白相对表达量比较，经t 检验，差异有统计学意义（P <0.05），AAD组miRNA-183相对表达量低于NC组，而MMP-9蛋白相对表达量高于NC组。见
| 组别 | miRNA-183 | MMP-9蛋白 |
|---|---|---|
| AAD组 | 0.55±0.21 | 0.97±0.04 |
| NC组 | 1.01±0.15 | 0.64±0.13 |
| t 值 | -5.668 | 4.728 |
| P 值 | 0.000 | 0.013 |
图1 各组MMP-9蛋白的表达
对细胞进行转染后，Mimic组、Inhibitor组、对照组miRNA-183、MMP-9 mRNA和蛋白、Elastin相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，Mimic组miRNA-183、Elastin蛋白相对表达量升高（P <0.05），MMP-9 mRNA和蛋白相对表达量降低（P <0.05）；Inhibitor组miRNA-183、Elastin相对表达量降低（P <0.05），MMP-9 mRNA和蛋白相对表达量升高（P <0.05）。见
| 组别 | miRNA-183 | MMP-9 mRNA | MMP-9蛋白 | Elastin蛋白 |
|---|---|---|---|---|
| Mimic组 | 1.59±0.19 | 0.62±0.15 | 0.32±0.03 | 1.22±0.11 |
| Inhibitor组 | 0.82±0.15 | 1.53±0.17 | 1.19±0.1 | 0.31±0.06 |
| 对照组 | 1.01±0.07 | 1.01±0.13 | 0.69±0.02 | 0.79±0.04 |
| F 值 | 33.649 | 49.109 | 139.958 | 110.194 |
| P 值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
图2 过表达或抑制miR-183对MMP-9、Elastin蛋白表达的影响
AAD是一种严重威胁人类生命的心血管疾病，病情危急凶险，发病急骤、进展迅速、病死率高，每年发病率为4/10万～7/10万，且逐年上
散发性AAD的病理特征包括ECM的改变和平滑肌细胞的丢
miRNAs是由19～25个核苷酸组成的小分子单链非编码RNA，具有高度保守性，以碱基互补配对的方式与靶基因mRNAs的3´-非编码区特异性结合，转录后调控靶基因表达，参与大多数生物过
综上所述，miR-183在AAD患者主动脉组织中低表达，MMP-9蛋白则高表达，上调或下调miR-183的表达能够在mRNA和蛋白水平上影响MMP-9的表达，从而改变Elastin的表达水平。miRNA-183调控平滑肌细胞中MMP-9的表达，参与主动脉中膜ECM重塑过程，为AAD发病机制的研究提供新思路。
参考文献
SCHLATMANN T J, BECKER A E. Pathogenesis of dissecting aneurysm of aorta. Comparative histopathologic study of significance of medial changes[J]. Am J Cardiol, 1977, 39(1): 21-26. [百度学术]
于长江, 方妙弦, 李欣, 等. 主动脉夹层致病基因及分子机制的研究进展[J]. 岭南心血管病杂志, 2017, 23(5): 640-642. [百度学术]
CHEN J, WANG D. microRNAs in cardiovascular development[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2012, 52(5): 949-957. [百度学术]
HUANG H. Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) as a cancer biomarker and MMP-9 biosensors: recent advances[J]. Sensors (Basel), 2018, 18(10): 3249. [百度学术]
FAN D, WANG Y, QI P, et al. MicroRNA-183 functions as the tumor suppressor via inhibiting cellular invasion and metastasis by targeting MMP-9 in cervical cancer[J]. Gynecologic Oncology, 2016, 141(1): 166-174. [百度学术]
RUAN H, LIANG X, ZHAO W, et al. The effects of microRNA-183 promots cell proliferation and invasion by targeting MMP-9 in endometrial cancer[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 89: 812-818. [百度学术]
HOWARD D P J, BANERJEE A, FAIRHEAD J F, et al. Population-based study of incidence and outcome of acute aortic dissection and premorbid risk factor control: 10-year results from the oxford vascular study[J]. Circulation, 2013, 127(20): 2031-2037. [百度学术]
MCCLURE R S, BROGLY S B, LAJKOSZ K, et al. Epidemiology and management of thoracic aortic dissections and thoracic aortic aneurysms in Ontario, Canada: A population-based study[J]. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2018, 155(6): 2254-2264. [百度学术]
HIRST A J, JOHNS V J, KIME S J. Dissecting aneurysm of the aorta: a review of 505 cases[J]. Medicine (Baltimore), 1958, 37(3): 217-279. [百度学术]
EVANGELISTA A, ISSELBACHER E M, BOSSONE E, et al. Insights from the international registry of acute aortic dissection[J]. Circulation, 2018, 137(17): 1846-1860. [百度学术]
QUINTANA R A, TAYLOR W R. Cellular mechanisms of aortic aneurysm formation[J]. Circulation Research, 2019, 124(4): 607-618. [百度学术]
GUO D C, PAPKE C L, HE R, et al. Pathogenesis of thoracic and abdominal aortic aneurysms[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2006, 1085(1): 339-352. [百度学术]
TANG P C Y, COADY M A, LOVOULOS C, et al. Hyperplastic cellular remodeling of the media in ascending thoracic aortic aneurysms[J]. Circulation, 2005, 112(8): 1098-1105. [百度学术]
van DOREN S R. Matrix metalloproteinase interactions with collagen and elastin[J]. Matrix Biology, 2015, 44-46: 224-231. [百度学术]
RABKIN S W. The role matrix metalloproteinases in the production of aortic aneurysm[J]. Prog Mol Biol Transl Sci, 2017, 147: 239-265. [百度学术]
NAGASAWA A, YOSHIMURA K, SUZUKI R, et al. Important role of the angiotensin Ⅱ pathway in producing matrix metalloproteinase-9 in human thoracic aortic aneurysms[J]. J Surg Res, 2013, 183(1): 472-477. [百度学术]
BARTEL D P. MicroRNAs[J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297. [百度学术]
MILEWICZ D M. MicroRNAs, fibrotic remodeling, and aortic aneurysms[J]. Journal of Clinical Investigation, 2012, 122(2): 490-493. [百度学术]
TANAKA H, SASAYAMA T, TANAKA K, et al. MicroRNA-183 upregulates HIF-1alpha by targeting isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) in glioma cells[J]. J Neurooncol, 2013, 111(3): 273-283. [百度学术]
ZHANG Y, ZHAN Y, LIU D, et al. Inhibition of microRNA-183 expression resists human umbilical vascular endothelial cells injury by upregulating expression of IRS1[J]. Drug Deliv, 2019, 26(1): 612-621. [百度学术]
