摘要
将44只雄性小鼠随机分为假手术组（8只）、模型组（18只）、褪黑素组（18只）。复制CA模型后褪黑素组小鼠给予褪黑素药物治疗（10 mg/kg）。术后第3天进行神经功能评分（9分法），并观察10 d存活率。CA模型复制后6 h取小鼠脑组织，通过Western blotting检测小鼠脑组织GRP78、Chop、p-PERK、p-eIF2a、ATF4蛋白相对表达量，应用ELISA测定丙二醛（MDA）水平，同时取血清测定乳酸脱氢酶（LDH）活性。苏木精-伊红染色评估脑组织海马CA1区损伤情况。
小鼠均复苏成功。各组小鼠体重、心率、平均动脉压、胸外按压时间、肾上腺素用量、自主呼吸恢复时间比较，差异无统计学意义（P >0.05）。各组小鼠术后10 d生存率比较，差异无统计学意义（P >0.05）。模型组神经功能评分较假手术组低（P <0.05），褪黑素组较模型组高（P <0.05）。模型组CA1区神经元细胞死亡数量较假手术组多（P <0.05），褪黑素组较模型组少（P <0.05）。模型组LDH活性、MDA水平较假手术组高（P <0.05），褪黑素组较模型组低（P <0.05）。模型组脑组织GRP78、Chop、p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白相对表达量较假手术组高（P <0.05），褪黑素组较模型组低（P <0.05）。
脑组织缺血再灌注导致的损伤是心脏骤停（cardiac arrest, CA）后死亡的首要病
44只健康、雄性、成年、体重18～24 g的BALB/c小鼠，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2021-0013，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2020-0050，购于常州卡文斯实验动物有限公司。小鼠随机分为假手术组（8只）、模型组（18只）、褪黑素组（18只）。动物饲养及实验方案均严格按照医院动物伦理委员会动物实验规范执行。
体视显微镜（SANQTID 8-50X）购自深圳市三锵泰达光学仪器有限公司，生物信号采集处理系统（MADLAB-4C/501H型）购自北京众实迪创科技发展有限责任公司，呼吸机购自河南省新乡市原阳县振华教学仪器有限公司。褪黑素（C10260299）购自上海麦克林生化科技有限公司，肝素（EHJID-HEP001）购自浙江惠嘉生物科技有限公司，氯化钾（10016308）购自上海国药集团化学试剂有限公司，盐酸肾上腺素（200116）购自宁波第二激素厂，丙二醛（Malondialdehyde, MDA）检测试剂盒（K739-100）购自美国Biovision公司，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性检测试剂盒（KGT02424）购自江苏凯基生物技术股份有限公司，兔抗小鼠一抗GRP78（#3177）、Chop（#3177）、PERK（#3192）、eIF2α（#5324）、p-eIF2α（#3398）、ATF4（#11815）、β-actin（#4970）、山羊抗兔二抗（#7074）购自美国Cell Signaling Technology公司，p-PERK（bs-3330R）购自北京博奥森生物技术有限公司。
小鼠手术前夜禁食，可自由饮水。术前称重，使用异氟烷吸入麻醉后气管插管，接入呼吸机，异氟烷维持浓度为1.5%，吸入氧浓度30%、氮气70%，固定小鼠，并记录标准Ⅰ导联心电图，将测温探头置于颞肌，加温头部至37.5℃，并维持10 min。剔除右侧胸前区和右腹股沟区鼠毛，先后予以乙醇和络合碘消毒。消毒后以右侧胸锁关节为中心斜下、右腹股沟沿大腿切开0.7～1.0 cm，分离颈外静脉、股动脉。于股动脉置入PE10管，并接入血压监测系统检测血压，于颈外静脉置入PE10管（PE管预充1%肝素盐水）。PE10管连接于充有50 μL 1%肝素的注射器。置管后注射25 μL 1%肝素，随后抽吸300～350 μL血液。待脑温达37.5℃后迅速注射30 μL 0.5 mol/L氯化钾，关闭呼吸机、麻醉药物、氮气，将氧气浓度调至100%。心脏骤停2 min后将先前抽取的血液1 min内注射进小鼠体内。小鼠心脏骤停7 min 30 s后缓慢静脉泵入3.2%肾上腺素（1.2 mL/h）。小鼠心脏骤停8 min时打开呼吸机，心脏按压（300次/min），静脉快速泵入3.2%肾上腺素100 μL后继续以1.2 mL/h速度持续静脉泵入。自主循环恢复后停止按压，继续静脉泵入3.2%肾上腺素50 μL，自主循环恢复10 min后将吸入氧气浓度调整为50%、氮气浓度调整为50%，30 min后关闭呼吸机、氧气、氮气，并放置于鼠笼恢复。心脏按压2 min 30 s尚未恢复自主循环视为复苏失败，作为排除标准。实验整个过程维持脑温37.5℃。因股动脉穿刺术后小鼠右下肢瘫痪，无法进行行为学检测，各组选取5只测定血压，其余不进行血压监测。假手术组术前准备同上。待脑温达到37.5℃、吸入氧浓度调至100%时，不予以注射肾上腺素。待18 min后将吸入氧气浓度调整为50%、氮气浓度调整为50%，38 min后撤股动脉管、缝合皮肤，关闭呼吸机、氧气、氮气，置于鼠笼恢复。假手术组不予任何处理。褪黑素组于术前30 min腹腔注射褪黑素（10 mg/kg），术后第2天开始以同样剂量腹腔注射，2次/d。模型组注射1%乙醇盐水，注射时间和方式同褪黑素组。
各组小鼠心脏骤停后第3天进行行为学测定。神经功能评分采用9分
Western blotting检测小鼠脑组织GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、Chop蛋白相对表达量。心脏骤停后6 h取各组小鼠全脑，各组剪取适当大小脑组织加入到裂解液中裂解，裂解完后4℃、12 000 r/min离心5 min，采用BCA法测定蛋白浓度，根据测定结果对蛋白浓度进行调整。取等量蛋白样品依次进行8% SDS-PAGE电泳和转膜，随后室温摇床封闭2 h。分别加入相应一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，再用二抗（1∶2000）37℃摇床孵育2 h。以β-actin作为内参，ECL显色曝光、照相，采用Image J软件处理图像，计算目标蛋白与β-actin灰度比值。
心脏骤停术后6 h取动脉血500 μL，静置后离心取血清，检测LDH活性；取10 mg脑组织，加入1 mL的MDA裂解液（已加入3 μL 100×BHT）匀浆，以13 000 r/min离心10 min，取上清液，测定MDA水平。样品制备完成后，严格按照试剂盒说明书操作。
小鼠均复苏成功。各组小鼠体重、心率、平均动脉压、胸外按压时间、肾上腺素用量、自主呼吸恢复时间比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见
| 组别 | n | 体重/g | 心率/（次/min） | 平均动脉压/mmHg | 胸外按压时间/s | 肾上腺素用量/μL | 自主呼吸恢复时间/s |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 假手术组 | 8 | 20.1±2.2 | 540.0±21.3 | 76.1±3.2 | - | - | - |
| 模型组 | 18 | 21.2±2.2 | 544.5±19.1 | 76.4±4.5 | 87.4±32.1 | 263.1±39.4 | 413.1±68.2 |
| 褪黑素组 | 18 | 21.1±2.0 | 541.2±15.1 | 75.1±2.5 | 78.1±25.0 | 264.3±41.2 | 390.2±62.2 |
| F / t 值 | 0.818 | 0.192 | 0.541 | 0.940 | 0.075 | 1.060 | |
| P 值 | 0.448 | 0.826 | 0.586 | 0.354 | 0.941 | 0.296 |
模型组术后第5、7及8天分别死亡1只，10 d生存率为70%，褪黑素组第9天死亡1只，10 d生存率为90%，假手术组小鼠10 d内无死亡情况。各组小鼠术后10 d生存率比较，经Monte Carlo近似法检验，差异无统计学意义（P =0.286）。
假手术组、模型组、褪黑素组神经功能评分分别为（8.91±0.08）分、（4.40±0.97）分、（6.20±0.63）分，经方差分析，差异有统计学意义（F =115.012，P =0.005），模型组较假手术组低（P <0.05），褪黑素组较模型组高（P <0.05）。表明褪黑素能够缓解CA引起的脑神经功能损伤。
假手术组、模型组、褪黑素组CA1区神经元细胞死亡数量分别为（9.05±1.84）个/Hp、（22.11±3.28）个/Hp、（15.35±3.50）个/Hp，经方差分析，差异有统计学意义（F =16.340，P =0.0037），模型组较假手术组多（P <0.05），褪黑素组较模型组少（P <0.05）。见
图1 各组脑海马CA1区神经细胞元死亡光镜图
假手术组 模型组 褪黑素组
各组LDH活性、MDA水平比较，差异有统计学意义（P <0.05），模型组较假手术组高（P <0.05），褪黑素组较模型组低（P <0.05）。提示褪黑素能够缓解CA/CPR引起的脑神经损伤。见
| 组别 | LDH活性/（u/L） | MDA水平/（nmol/mg） |
|---|---|---|
| 假手术组 | 466.35±32.98 | 3.99±0.40 |
| 模型组 | 641.63±42.34 | 12.59±0.81 |
| 褪黑素组 | 519.56±35.55 | 7.39±1.11 |
| F 值 | 17.540 | 82.430 |
| P 值 | 0.003 | 0.000 |
各组脑组织GRP78、Chop、p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P <0.05），模型组较假手术组高（P <0.05），褪黑素组较模型组低（P <0.05）。见
| 组别 | GRP78 | Chop | ATF4 | p-eIF2α | p-PERK |
|---|---|---|---|---|---|
| 假手术组 | 0.26±0.05 | 0.37±0.02 | 0.27±0.03 | 0.51±0.03 | 0.22±0.02 |
| 模型组 | 0.93±0.04 | 0.78±0.03 | 0.77±0.04 | 0.99±0.01 | 0.72±0.03 |
| 褪黑素组 | 0.57±0.04 | 0.56±0.03 | 0.48±0.02 | 0.83±0.04 | 0.43±0.03 |
| F 值 | 190.400 | 192.500 | 186.200 | 184.600 | 297.500 |
| P 值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
图2 脑组织中内质网应激及其通路相关蛋白的表达
目前公认的心脏骤停后脑复苏最有效的治疗策略是脑部低温治疗，但是其疗效十分有限。因此，探寻新的、有效的治疗方法具有重要意义。本研究结果显示，褪黑素组神经功能评分及脑海马CA1区神经元细胞死亡检测结果均显著优于模型组，3组CA/CPR后10 d小鼠存活率比较差异无统计学意义，但褪黑素组小鼠存活率高于模型组，说明褪黑素对CA/CPR后脑缺血/再灌注损伤有一定的保护作用。
褪黑素是松果体分泌的一种激素，具有高脂溶性，能通过血脑屏障进入神经细胞和神经胶质细胞中发挥作
综上所述，褪黑素对CA/CPR后小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。其机制可能是通过抑制PERK-eIF2α-ATF4信号通路，从而缓解内质网应激，减轻神经损伤。
参 考 文 献
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