摘要
选取2016年2月—2019年9月诸暨市人民医院收集的宫颈脱落细胞标本172例，其中正常组70例、宫颈上皮内瘤变组54例、宫颈癌组48例。通过qRT-PCR、免疫组织化学、Western blotting检测各组细胞miR-508-3p、ROCK1的表达，荧光素酶报告实验验证宫颈病变脱落细胞miR-508-3p与ROCK1的相关性，观察宫颈癌脱落细胞miR-508-3p、ROCK1表达与宫颈癌患者临床资料的关系，通过受试者工作特征（ROC）曲线评估宫颈病变脱落细胞miR-508-3p、ROCK1表达对宫颈病变的诊断价值。
与正常组比较，宫颈癌组和宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p降低（P <0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA阳性率、ROCK1蛋白相对表达量升高（P <0.05）；与宫颈上皮内瘤变组比较，宫颈癌组miR-508-3p降低，ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA阳性率、ROCK1蛋白相对表达量升高（P <0.05）。宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p与ROCK1 mRNA呈负相关（r =-0.6678和-0.5234，均P =0.000），ROCK1是miR-508-3p的直接靶基因。miR-508-3p、ROCK1水平与宫颈癌患者FIGO分期、淋巴结转移有关（P <0.05），与年龄、绝经情况、肿瘤直径及病理类型无关（P >0.05）。在诊断宫颈癌和宫颈上皮内瘤变时，miR-508-3p的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.946（95% CI：0.899，0.993）和0.851（95% CI：0.782，0.921），敏感性为87.1%（95% CI：0.776，1.654）和84.3%（95% CI：0.746，1.589），特异性为100.0%（95% CI：1.000，2.000）和79.6%（95% CI：0.702，1.497）；ROCK1的AUC分别为0.949（95% CI：0.892，1.000）和0.905（95% CI：0.852，0.958），敏感性为89.6%（95% CI：0.810，1.706）和77.8（95% CI：0.667，1.445），特异性为100.0%（95% CI：1.000，2.000）和88.6%（95% CI：0.812，1.698）。随访1年后，48例宫颈癌患者中生存42例，死亡6例。生存组miR-508-3p高于死亡组（P <0.05），ROCK1 mRNA相对表达量低于死亡组（P <0.05）。
关键词
宫颈癌是全球女性第4大常见癌
MicroRNA（miRNAs）作为重要的基因调节因子，参与多种细胞内通路的调
选取2016年2月-2019年9月诸暨市人民医院收集的宫颈脱落细胞标本172例。其中正常组（病理检查正常）70例，年龄32～60岁；宫颈上皮内瘤变组（病理学检查为宫颈上皮内瘤
通过宫颈脱落细胞学检查，宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者符合相关诊断标
Trizol、PrimeScript RT试剂盒、RNA酶抑制剂由丹麦DAKO公司提供，免疫显色试剂miR-508-3p、ROCK1、U6、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司设计，离心机由上海精密仪器仪表有限公司提供，酶标仪由上海沃元科技有限公司提供，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪由杭州艾康生物技术有限公司提供，免疫组织化学试剂盒购自瑞士罗氏公司，ROCK1、GAPDH相关抗体购自美国圣克鲁斯生物技术公司。
提取总RNA。将收集的全部宫颈脱落细胞标本保存于含细胞保存液的离心管中，离心弃上清液，加入Trizol溶液，用移液枪反复吹打后转移至灭菌管中，放置10 min，加入0.2 ml氯仿，混匀后冰上静置30 min，离心弃上清液，再转移至灭菌管中，加入等量的异丙醇，混匀后冰上静置15 min，离心弃上清液，加入75%乙醇焦碳酸二乙酯水溶液1 ml，混匀后离心弃上清液，倒置在吸水纸上吸干，加入10 μl DEPC水溶液，冰上静置30 min使RNA充分溶解，或置入-80℃冰箱冷冻保存待用。再采用Stem-loopRT法（反应体系：PrimeScript RT enzyme 0.8 μl，PrimeScript RT Buffer 2.0 μl，RNA酶抑制剂 0.2 μl，各基因RT引物0.2 μl）在PCR仪中进行逆转录，合成cDNA。反应条件：16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min，4℃持续。qRT-PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共计40个循环。其中miR-508-3p以U6为内参，ROCK1以GAPDH为内参。采用
| 基因 | 引物序列 | 长度/bp |
|---|---|---|
| miR-508-3p | 正向： 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' | 17 |
| 反向： 5'-TATCGTTGTACTCCAGACCAAGAC-3' | 24 | |
| ROCK1 | 正向： 5'-AACATGCTGCTGGATAAATCTGG-3' | 23 |
| 反向： 5'-TGTATCACATCGTACCATGCCT-3' | 22 | |
| U6 | 正向： 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' | 17 |
| 反向： 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' | 20 | |
| GAPDH | 正向： 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' | 20 |
| 反向： 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' | 20 |
将收集的宫颈脱落细胞标本制成细胞薄片，通过免疫组织化学链霉素抗生物-过氧化物酶法检测ROCK1蛋白。ROCK1蛋白免疫组织化学阳性判定标准：ROCK1蛋白在细胞质或细胞核中呈黄色或棕黄色表达。ROCK1蛋白阳性表达率（%）=ROCK1阳性细胞/全部脱落细胞×100%。
提取各标本中总蛋白，将提取出的蛋白100℃煮沸5 min，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转膜，5%牛血清白蛋白室温密封1 h，加入一抗（1∶1 000稀释）ROCK1及GAPDH 4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液冲洗，加入相应二抗，室温孵育1 h，显色，暗室曝光，采用ImageJ 2x软件分析灰度值。
通过http：//www.targetscan.org网站预测miR-508-3p和ROCK1的靶向关系，以及miR-508-3p与ROCK1 3'-UTR的结合位点。合成含miR-508-3p结合位点的ROCK1 3'-UTR启动子区序列，构建ROCK1 3'-UTR野生型（wild type, WT）质粒（ROCK1-WT）。并在该质粒基础上构建ROCK1 3'-UTR突变型（mutant type, MUT）质粒（ROCK1-MUT）。参照质粒提取试剂盒说明书进行操作。将ROCK1-WT、ROCK1-MUT质粒分别与mimics NC、miR-508-3p mimics质粒混匀后共转染。转染48 h后通过荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性。
查阅并统计行宫颈癌手术患者的年龄、绝经情况、肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移、病理类型（鳞癌及腺癌）。参照miR-508-3p及ROCK1中位值将宫颈癌患者分为高表达组与低表达组，对上述两种基因与宫颈癌病理特征的关系进行分析。全部宫颈癌患者随访1年，统计其生存、死亡例数。
正常组、宫颈上皮内瘤变组、宫颈癌组脱落细胞miR-508-3p、ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA阳性率、ROCK1蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较：与正常组比较，宫颈癌组和宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p降低（P <0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA阳性率、ROCK1蛋白相对表达量升高（P <0.05）；与宫颈上皮内瘤变组比较，宫颈癌组miR-508-3p降低（P <0.05），ROCK1 mRNA、ROCK1 mRNA阳性率、ROCK1蛋白相对表达量升高（P <0.05）。见
| 组别 | n | miR-508-3p | ROCK1 mRNA | ROCK1 mRNA阳性率/% | ROCK1蛋白 |
|---|---|---|---|---|---|
| 宫颈癌组 | 48 | 0.67±0.19 | 2.80±0.61 | 69.78±10.14 | 1.15±0.17 |
| 宫颈上皮内瘤变组 | 54 | 1.05±0.24 | 1.95±0.50 | 36.77±8.50 | 0.47±0.08 |
| 正常组 | 70 | 1.63±0.53 | 1.18±0.32 | 1.28±0.16 | 0.16±0.03 |
| F 值 | 96.550 | 168.102 | 1324.006 | 1355.102 | |
| P 值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
图1 各组宫颈脱落细胞中ROCK1的表达 （免疫组织化学×200）
宫颈癌组 宫颈上皮内瘤变组 正常组
图2 各组宫颈脱落细胞ROCK1蛋白的表达
宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p与ROCK1 mRNA均呈负相关（r =-0.6678和-0.5234，均P =0.000）。见图
图3 宫颈癌组miR-508-3p与ROCK1 mRNA的相关性散点图
图4 宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p与ROCK1 mRNA的相关性散点图
ROCK1是miR-508-3p的预测靶基因（见
图5 Targetscan网站预测miR-508-3p与ROCK1的靶向关系
不同FIGO分期、有无淋巴结转移患者的miR-508-3、ROCK1表达水平比较，经
| 临床病理特征 | miR-508-3p | P 值 | ROCK1 | P 值 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 低表达 | 高表达 | 低表达 | 高表达 | |||||
| 年龄 | ||||||||
| ≥ 45岁 | 13（54.17） | 17（70.83） | 1.422 | 0.233 | 14（58.33） | 16（66.67） | 0.356 | 0.551 |
| < 45岁 | 11（45.83） | 7（29.17） | 10（41.67） | 8（33.33） | ||||
| 绝经情况 | ||||||||
| 绝经 | 10（41.67） | 12（50.00） | 0.336 | 0.562 | 9（37.50） | 13（54.17） | 1.343 | 0.247 |
| 未绝经 | 14（58.33） | 12（50.00） | 15（62.50） | 11（45.83） | ||||
| 肿瘤直径 | ||||||||
| ≥ 4 cm | 9（37.50） | 6（25.00） | 0.873 | 0.350 | 5（20.83） | 10（41.67） | 2.424 | 0.119 |
| < 4 cm | 15（62.50） | 18（75.00） | 19（79.17） | 14（58.33） | ||||
| FIGO分期 | ||||||||
| Ⅰ期 | 5（20.83） | 20（83.33） | 17（70.83） | 8（33.33） | ||||
| ⅡA期 | 9（37.50） | 4（16.67） | 20.923 | 0.000 | 6（25.00） | 7（29.17） | 9.717 | 0.008 |
| ⅡB期 | 10（41.67） | 0（0.00） | 1（4.17） | 9（37.50） | ||||
| 淋巴结转移 | ||||||||
| 有 | 10（41.67） | 1（4.17） | 9.553 | 0.002 | 2（8.33） | 9（37.50） | 5.779 | 0.016 |
| 无 | 14（58.33） | 23（95.83） | 22（91.67） | 15（62.50） | ||||
| 病理类型 | ||||||||
| 鳞癌 | 19（79.17） | 20（83.33） | 0.137 | 0.712 | 21（87.50） | 18（75.00） | 1.231 | 0.267 |
| 腺癌 | 5（20.83） | 4（16.67） | 3（12.50） | 6（25.00） | ||||
miR-508-3p诊断宫颈癌的ROC曲线下面积（area under curve, AUC）为0.946，敏感性为87.1%，特异性为100.0%，约登指数为0.871。miR-508-3p诊断宫颈上皮内瘤变的AUC为0.851，敏感性为84.3%，特异性为79.6%，约登指数为0.639。见
| 指标 | AUC | 95% CI | 敏感性/% | 95% CI | 特异性/% | 95% CI | 约登指数 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 下限 | 上限 | 下限 | 上限 | 下限 | 上限 | |||||
| miR-508-3p | ||||||||||
| 宫颈癌 | 0.946 | 0.899 | 0.993 | 87.1 | 0.776 | 1.654 | 100.0 | 1.000 | 2.000 | 0.871 |
| 宫颈上皮内瘤变 | 0.851 | 0.782 | 0.921 | 84.3 | 0.746 | 1.589 | 79.6 | 0.702 | 1.497 | 0.639 |
| ROCK1 | ||||||||||
| 宫颈癌 | 0.949 | 0.892 | 1.000 | 89.6 | 0.810 | 1.706 | 100.0 | 1.000 | 2.0010 | 0.896 |
| 宫颈上皮内瘤变 | 0.905 | 0.852 | 0.958 | 77.8 | 0.667 | 1.445 | 88.6 | 0.812 | 1.698 | 0.663 |
A
B
C
D
图6 miR-508-3p、ROCK1诊断宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的ROC曲线
A：miR-508-3p诊断宫颈癌的ROC曲线；B：miR-508-3p诊断宫颈上皮内瘤变的ROC曲线；C：ROCK1诊断宫颈癌的ROC曲线；D：ROCK1诊断宫颈上皮内瘤变的ROC曲线。
ROCK1诊断宫颈癌的AUC为0.949，敏感性为89.6%，特异性为100.0%，约登指数为0.896。ROCK1诊断宫颈上皮内瘤变的AUC为0.905，敏感性为77.8%，特异性为88.6%，约登指数为0.663。见
随访1年后，48例宫颈癌患者中生存42例，死亡6例。生存组与死亡组miR-508-3p和ROCK1 mRNA相对表达量比较，经t 检验，差异有统计学意义（P <0.05），生存组miR-508-3p高于死亡组，ROCK1 mRNA相对表达量低于死亡组。见
| 组别 | n | miR-508-3p | ROCK1 mRNA |
|---|---|---|---|
| 生存组 | 42 | 0.72±0.21 | 2.35±0.42 |
| 死亡组 | 6 | 0.32±0.08 | 5.95±1.08 |
| t 值 | 4.582 | 15.478 | |
| P 值 | 0.000 | 0.000 |
约90%宫颈癌死亡患者处于低收入和中等收入国家，特别是在艾滋病流行率较高的地区，这主要是由于预防、筛查机会及治疗选择有
miRNAs是一类小分子非编码RNA序列，参与多种重要的生物学行为，在多种恶性肿瘤中均有miRNA异常表
自巴氏以形态学为基础创立的涂片宫颈脱落细胞学检查被应用于宫颈癌的筛查，宫颈癌患病率及病死率明显降
本研究结果显示，miR-508-3p相对表达量在正常组、宫颈上皮内瘤变组及宫颈癌组中依次递减，说明当miR-508-3p呈低表达趋势时，宫颈病变越严重，而ROCK1表达与之相反，同时暗示两者存在一定的负调控关系。相关性分析结果显示，宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组miR-508-3p与ROCK1 mRNA均呈负相关，推测miR-508-3p可能通过靶向负调控ROCK1的表达，参与宫颈病变的发生、发展。荧光素酶报告实验结果表明，miR-508-3p可能通过介导ROCK1的表达来调节宫颈癌细胞的恶性生物学行为，进而对宫颈癌的发生、发展起到一定的调控作用，而关于两者与宫颈癌细胞生物学行为作用机制的研究有待进一步探讨。
本研究结果显示，miR-508-3p、ROCK1表达水平与宫颈癌患者的FIGO分期、淋巴结转移有关，而与年龄、绝经情况、肿瘤直径及病理类型无关。提示宫颈癌患者宫颈脱落细胞miR-508-3p表达水平越低，ROCK1表达水平越高时，患者病情恶化越严重。这对宫颈癌的早期诊断具有一定的辅助意义。ROC曲线结果显示，miR-508-3p和ROCK1诊断宫颈癌的AUC分别为0.946和0.949；miR-508-3p和ROCK1诊断宫颈上皮内瘤变的AUC分别为0.851和0.905，说明两者在宫颈癌的筛查中具有较好的诊断价值。随访1年后，生存组miR-508-3p高于死亡组，ROCK1 mRNA相对表达量低于死亡组，说明两者对预后有预测作用。
综上所述，宫颈脱落细胞miR-508-3p、ROCK1在宫颈癌患者中表达异常，其中miR-508-3p下调，ROCK1上调，两者呈靶向负调控关系，并与宫颈癌患者FIGO分期及淋巴结转移密切相关，具有一定的宫颈癌诊断价值，可作为早期宫颈癌筛查的潜在生物学指标。
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