摘要
通过腹腔注射链脲佐菌素复制DN大鼠模型，并将其随机分为DN组、DN+TG组和DN+TG+SC79组（每组15只），另取15只健康大鼠作为对照组。TG灌胃剂量为20 mg/kg。大鼠腹膜内注射SC79（0.04 mg/g）以激活PI3K/Akt通路。通过HE染色验证模型复制结果和TG对肾组织的保护作用。生化检测大鼠24 h尿蛋白和肌酐，酶联免疫吸附试验检测炎症因子水平，HE染色观察各组大鼠肾损伤情况，Masson染色观察各组大鼠肾纤维化情况，qRT-PCR和Western blotting 分别检测HPS90和PGC-1α mRNA和蛋白相对表达量。
DN组24 h尿蛋白、肌酐、肾组织纤维化面积百分比、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HSP90 mRNA和蛋白相对表达量、IL-1β及IL-6高于对照组（P <0.05），PGC-1α mRNA和蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）；DN+TG组24 h尿蛋白、肌酐、肾组织纤维化面积百分比、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HSP90 mRNA和蛋白相对表达量、IL-1β及IL-6低于DN组（P <0.05），PGC-1α mRNA和蛋白相对表达量高于DN组（P <0.05）。DN+TG+SC79组24 h尿蛋白、肌酐、肾组织纤维化面积百分比、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HSP90 mRNA和蛋白相对表达量、IL-1β及IL-6高于DN+TG组（P <0.05），PGC-1α mRNA和蛋白相对表达量低于DN+TG组（P <0.05）。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是由高糖微环境引起的多种病理机制协同作用导致的肾组织细胞凋亡和纤维化，表现为肾功能逐渐下
65只SD大鼠SPF级，雄性，12周，体重220～250 g，购自华北制药股份有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK（冀）2019-004，实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2019-011。取50只SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素（60 mg/kg，pH=4.5）复制DN模
链脲佐菌素（上海如吉生物科技发展有限公司），PI3K/Akt通路激动剂SC79（S7863）（上海碧云天生物技术有限公司），酶联免疫吸附试验试剂盒（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）（南京森贝伽生物科技有限公司），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）和Masson染色试剂盒、RNAspin Mini和miRNeasy Mini试剂盒、Bestar qRT-PCR和Bestar qRT-PCR试剂盒、TaqMan miRNA试剂盒、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000稀释，#ab6721）、硝酸纤维素膜、电化学发光（electrochemiluminescence, ECL）显色试剂盒购自广州易锦生物技术有限公司。SMT100V小动物自动生化分析仪、显微镜购自上海易毕恩生物技术有限公司。
通过SMT100V小动物自动生化分析仪检测大鼠24 h尿蛋白和肌酐，评估肾功能。收集大鼠尾静脉血，2 000 r/min离心20 min，收集上层血清，用ELISA试剂盒检测白细胞介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）和IL-6，用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，然后根据标准曲线计算IL-1β和IL-6水平。
大鼠安乐死后取出肾组织并在室温条件下用4%多聚甲醛固定6 h。乙醇脱水（从低浓度到高浓度）后，将组织包埋在石蜡中，制作5 μm厚的切片，固定在载玻片上。载玻片在室温条件下用苏木精染色10 min，自来水洗涤1～2 min后将载玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片变蓝。随后用自来水清洗1～2 min后将载玻片放入曙红中10 s。用乙醇（浓度分别为70%、90%、95%和100%）脱水后，将载玻片置于二甲苯中2 min；重复此步骤1次。最后用中性胶密封玻片，在倒置显微镜下观察大鼠肾组织损伤情况。
将肾组织固定在10%中性甲醛缓冲液，石蜡包埋、切片（厚约4 μm），用Masson三色染色剂染色，以检测肾间质纤维化的面积。2位研究人员使用IDA-2000高分辨率数字显微镜和图像分析系统，在400倍放大镜下评估每个视野的纤维化面积百分比。
将肾组织置于RIPA裂解缓冲液中，冰上裂解。通过8% SDS-PAGE分离每个样品中等量（50 μg）蛋白，并将其转移到硝酸纤维素膜上。室温条件下将膜浸入5%脱脂牛奶中2 h，封闭非特异性抗原。膜与一抗体在4℃条件下孵育过夜，然后将膜与相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1 h。使用ECL显色试剂盒显色，Quantum One软件分析灰度，计算蛋白相对表达量。
采用RNeasy Mini试剂盒提取肾组织总RNA，Bestar qRT-PCR试剂盒逆转录为cDNA，条件如下：37℃ 15 min，98℃ 5 min。采用Bestar™ qRT-PCR预混液进行qRT-PCR实验，反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共计40个循环，72℃继续延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行qRT-PCR分析。通过比较循环阈值并以GAPDH作为内参，计算mRNA相对表达量。qRT-PCR引物序列见
| 基因 | 引物序列 | 引物长度/bp |
|---|---|---|
| HSP90 | 正向： 5´-CAGTGTCATGGTTCCTTGC-3´ | 104 |
| 反向： 5´-CACCGAGGAACTACCTGAT-3´ | ||
| PGC-1α | 正向： 5´-GGGCAAGAGAATCCACGAAG-3´ | 91 |
| 反向： 5´-GTTGTTGCTGGTCTTTCCCG-3´ | ||
| GAPDH | 正向： 5´-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3 | 138 |
| 反向： 5´-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3´ |
各组大鼠干预前的血糖水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）；各模型组大鼠干预前血糖均高于对照组，且> 16.67 mmol/L。各组大鼠干预后的血糖水平比较，经方差分析，差异有统计学意义义（P <0.05）；DN+TG组、DN+TG+SC79组低于DN组（P <0.05）。对照组、DN组大鼠干预前后的血糖水平比较，经t 检验，差异无统计学意义（t =0.842和0.126，P =0.412和0.106）。DN+TG组、DN+TG+SC79组大鼠干预前后的血糖水平比较，经t 检验，差异有统计学意义（t =35.058和36.821，均P =0.000），干预后血糖降低。见
| 组别 | 干预前 | 干预后 |
|---|---|---|
| 对照组 | 4.96±0.55 | 4.52±0.51 |
| DN组 | 29.05±2.44 | 30.11±2.84 |
| DN+TG组 | 29.67±2.21 | 22.05±2.15 |
| DN+TG+SC79组 | 30.21±2.38 | 23.97±2.34 |
| F 值 | 28.763 | 30.237 |
| P 值 | 0.001 | 0.001 |
对照组肾小球和肾小管正常；DN组肾小球出现水肿和炎症浸润，结构出现异常，肾小球膨大；DN+TG组肾小球结构基本完整，水肿和炎症浸润有所缓解；DN+TG+SC79组肾小球损伤情况与DN组类似。见
图1 各组大鼠肾组织损伤情况 （HE染色×400）
对照组 DN组 DN+TG组 DN+TG+SC79组
各组大鼠肾功能指标比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果：DN组24 h尿蛋白和肌酐高于对照组和DN+TG组（P <0.05）；DN+TG+SC79组的24 h尿蛋白和肌酐高于DN+TG组（P <0.05）。见
| 组别 | 24 h尿蛋白/mg | 肌酐/（μmol/L） |
|---|---|---|
| 对照组 | 24.57±3.85 | 28.35±3.96 |
| DN组 | 248.16±30.28 | 55.42±7.47 |
| DN+TG组 | 126.92±19.74 | 39.38±5.58 |
| DN+TG+SC79组 | 238.24±31.06 | 52.51±7.43 |
| F 值 | 25.179 | 23.731 |
| P 值 | 0.001 | 0.001 |
对照组、DN组、DN+TG组、DN+TG+SC79组的肾组织纤维化面积百分比分别为（3.74±0.45）%、（21.77±2.06）%、（7.94±0.91）%和（19.32±1.89）%，经方差分析，差异有统计学意义（F = 27.356，P =0.001）。进一步两两比较结果：DN组高于对照组和DN+TG组（P <0.05）；DN+TG+SC79组高于DN+TG组（P <0.05）。见
图2 各组大鼠肾纤维化情况 （Masson染色×400）
对照组 DN组 DN+TG组 DN+TG+SC79组
各组大鼠肾组织中PI3K/Akt通路激活情况比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果：DN组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt高于对照组和DN+TG组（P <0.05）；DN+TG+SC79组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt高于DN+TG组（P <0.05）。见
| 组别 | p-PI3K/PI3K | p-Akt/Akt |
|---|---|---|
| 对照组 | 0.56±0.05 | 0.41±0.04 |
| DN组 | 2.97±0.25 | 2.18±0.19 |
| DN+TG组 | 1.17±0.10 | 1.05±0.09 |
| DN+TG+SC79组 | 2.06±0.17 | 1.84±0.16 |
| F 值 | 19.765 | 22.124 |
| P 值 | 0.001 | 0.001 |
图3 各组大鼠肾组织中PI3K/Akt通路的表达
各组大鼠肾组织HSP90、PGC-1α mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果：DN组HSP90 mRNA相对表达量高于对照组和DN+TG组（P <0.05），而PGC-1α mRNA相对表达量低于对照组和DN+TG组（P <0.05）；DN+TG+SC79组HSP90 mRNA相对表达量高于DN+TG组（P <0.05），而PGC-1α mRNA相对表达量低于DN+TG组（P <0.05）。见
| 组别 | HSP90 mRNA | PGC-1α mRNA |
|---|---|---|
| 对照组 | 0.94±0.09 | 4.72±0.43 |
| DN组 | 4.89±0.45 | 0.91±0.09 |
| DN+TG组 | 3.01±0.28 | 3.54±0.41 |
| DN+TG+SC79组 | 4.74±0.45 | 1.45±0.22 |
| F 值 | 15.764 | 14.987 |
| P 值 | 0.001 | 0.001 |
各组大鼠肾组织HSP90和PGC-1α蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果：DN组HSP90蛋白相对表达量高于对照组和DN+TG组（P <0.05），而PGC-1α蛋白相对表达量低于对照组和DN+TG组（P <0.05）；DN+TG+SC79组HSP90蛋白相对表达量高于DN+TG组，而PGC-1α蛋白相对表达量低于DN+TG组（P <0.05）。见
| 组别 | HSP90蛋白 | PGC-1α蛋白 |
|---|---|---|
| 对照组 | 0.62±0.06 | 2.53±0.21 |
| DN组 | 3.64±0.32 | 0.58±0.05 |
| DN+TG组 | 2.31±0.21 | 2.06±0.18 |
| DN+TG+SC79组 | 3.38±0.30 | 0.91±0.09 |
| F 值 | 19.765 | 17.432 |
| P 值 | 0.001 | 0.001 |
图4 各组大鼠肾组织HSP90和PGC-1α蛋白的表达
各组大鼠炎症因子水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果：DN组IL-1β、IL-6水平高于对照组和DN+TG组（P <0.05）；DN+TG+SC79组IL-1β、IL-6水平高于DN+TG组（P <0.05）。见
| 组别 | IL-1β | IL-6 |
|---|---|---|
| 对照组 | 14.67±2.01 | 24.21±2.86 |
| DN组 | 86.32±9.65 | 96.75±9.39 |
| DN+TG组 | 38.76±4.63 | 49.02±5.67 |
| DN+TG+SC79组 | 80.77±9.44 |
91.34±10.4 |
| F 值 | 23.087 | 22.456 |
| P 值 | 0.001 | 0.001 |
全世界超过4亿人患有糖尿病，每年死亡370万
有研究显示，PI3K/Akt在DN中发挥重要作用，PI3K和Akt被磷酸化激活后，进入细胞核调节转录，从而促进炎症因子和ECM等的表达，损伤肾功
PI3K-Akt信号通路的活性可以被类脂磷酸酶PTEN和SHIP负调节，但迄今为止尚未发现下调Akt活性的特异磷酸酶，而用磷酸酶抑制剂处理细胞后，Akt的磷酸化和活性均有所增加。最近发现HSP90能结合Akt，阻止Akt被PP2A磷酸酶的去磷酸化而失活，因此具有保护Akt的作用。另外激活PI3K/Akt可磷酸化Sirt1，随后Sirt1乙酰化激活PGC-1α从而发挥其作用。为进一步分析TG通过PI3K/Akt缓解DN的作用机制，本文检测了HSP90和PGC-1α表达。HSP90的表达可被PI3K/Akt通路上
综上所述，TG可以通过抑制PI3K/Akt通路，抑制HSP90的转录和翻译，促进PGC-1α的表达，并发挥抗炎和抗纤维化作用，从而缓解DN。
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