lncRNA UCA1

摘要

目的

探究长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1（lncRNA UCA1）通过靶向miR-206调控Yes相关蛋白1（YAP1）的表达，介导口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞增殖、凋亡的分子机制。

方法

通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测人正常口腔角质细胞系HOK和人口腔鳞状细胞癌细胞株TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9中lncRNA UCA1和microRNA-206（miR-206）的表达；在HN13细胞中敲除IncRNA UCA1，采用CCK-8法和流式细胞术检测其对HN13细胞增殖和细胞凋亡的影响；通过生物信息学网站starBase预测IncRNA UCA1、YAP1与miR-206的互补结合位点，并通过双荧光素酶实验验证它们之间的结合关系；Western blotting检测YAP1蛋白的表达。

结果

qRT-PCR结果显示，相比于人正常口腔角质细胞系HOK，6种OSCC细胞中lncRNA UCA1 mRNA相对表达量上调（P <0.05），而miR-206 mRNA相对表达量均降低（P <0.05）。与转染siNC的对照组相比，siUCA1组细胞活力下降，凋亡比例升高（P <0.05）。生物信息学预测结合双荧光素酶实验证实miR-206与lncRNA UCA1、YAP1均存在互补结合。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示，siUCA1组miR-206 mRNA相对表达量较对照组升高（P <0.05），YAP1 mRNA相对表达量较对照组降低（P <0.05），而同时转染siUCA1和miR-206 inhibitor则抑制miR-206表达，恢复YAP1的表达（P <0.05）。

结论

lncRNA UCA1在OSCC细胞中高表达，通过抑制miR-206的表达，上调YAP1，从而促进OSCC细胞增殖，抑制凋亡。

关键词

口腔鳞状细胞癌; 长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1; 细胞增殖; 凋亡

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是最常见的头颈部肿瘤之一，是全球第六大最常见的癌症^[1-2]，发病率高，易发生淋巴结转移且易复发^[3-4]。虽然目前OSCC的临床诊断和治疗方法有所进步，但是患者的5年生存率并没有明显的改善^[5]。在过去的几年中，越来越多的研究证实长链非编码RNA（lncRNAs）参与了癌症的进展，有一部分研究还建议将其作为癌症标志物^[6]。lncRNAs是一类> 200个碱基且不具有蛋白编码能力的RNA分子^[7]，在细胞中具有多种功能，可以充当分子信号通过表观遗传，转录或转录后调节^[8-9]。越来越多的证据表明lncRNAs在癌症细胞增殖、分化、凋亡和癌细胞转移过程中发挥了重要作用^[10]。长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1（lncRNA UCA1）在膀胱癌、乳腺癌和结直肠癌中异常表达，在多种肿瘤中发挥致癌作用，包括胶质母细胞瘤、膀胱癌、胃癌和前列腺癌等^[11-14]。最近的研究也表明lncRNA UCA1参与了OSCC的进展^[15]，然而其在OSCC中的相关分子机制研究还很少。本研究旨在探讨lncRNA UCA1靶向miR-206调控YAP1基因对OSCC细胞增殖和细胞凋亡的影响，初步阐明其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1　主要材料及试剂

HOK、TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9细胞均购自中国科学院上海细胞库。细胞培养相关试剂均购自美国Gibco公司，Lipofectamine 3000和实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）相关试剂盒均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，YAP1一抗、二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，RNA引物由北京擎科生物科技有限公司合成，UCA1、miR-206、YAP1、miR-206 mimics、miR-206 inhibitor均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，流式细胞分析仪购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2　细胞培养

将HOK、TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9细胞接种于含10%胎牛血清、青霉素（100 u/mL）、链霉素（100 μg/mL）的DMEM培养基中，在5%二氧化碳、饱和湿度、37℃培养箱中培养，每2～3天传代1次。

1.3　采用Lipofectamine 3000进行细胞转染

将2×10⁵个/mL密度的HN13细胞接种于6孔板中并生长浓度至60%，换用无血清培养基培养。取浓度为100 nmol/L的siUCA1（阴性对照为siNC）或50 nmol/L miR-206 mimics（阴性对照为mimics NC）或50 nmol/L miR-206 inhibitor（阴性对照为inhibitor NC）分别加入200 μL无血清培基稀释，充分混匀，制成RNA稀释液。在2 μL的Lipofectamine 3000中加入198 μL无血清培养基稀释液体，充分混匀，制成Lipofectamine 3000稀释液，室温静置5 min。将2种稀释液充分混合，室温静置15 min，制备成转染复合物。将100 μL转染复合物滴加到含有1 mL无血清培养基的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。在5%二氧化碳、37℃培养箱内孵育6 h，换用正常培养基培养24 h用于后续实验。控制组不做任何处理，对照组使用随机siRNA序列转染，实验组使用siUCA1转染。

1.4　qRT-PCR检测

采用TRIzol一步法提取细胞RNA，40 μL无核酸酶水溶解，置入-80℃冷冻保存。取0.5 μg总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再行PCR扩增目标基因。预先设计合成引物，将所得cDNA加至PCR反应体系中扩增目标片段。在待测样品中加入1 μL模板、1 μL正向引物、1 μL反向引物、5 μL SYBR探针和3 μL DEPC水避光混匀后，上机检测相关分子的表达。反应条件：95℃预变性15 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。GAPDH和U6作为内参，根据2^-∆∆Ct法计算基因相对表达量。引物序列见表1。

表1  引物序列

基因	引物序列	引物长度/bp
UCA1	正向： 5'-TGACAACAGATAACCACCT-3'	19
	反向： 5'-TCCGTATAGAAGACCACCTA-3'	20
miR-206	正向： 5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3'	22
	反向： 5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'	22
YAP1	正向： 5'-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA	20
	反向： 5'-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3'	22
GAPDH	正向： 5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3'	22
	反向： 5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'	22
U6	正向： 5'-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3'	19
	反向： 5'-AACGATTCACGAATTTGCGT-3'	20

1.5　CCK-8法检测细胞增殖

以2×10³个/mL细胞密度接种于96孔板中，设置24 h、48 h、72 h和96 h 4个时间点，每组设5个复孔，培养过夜使细胞贴壁。待每组细胞处理并在相应时间点，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h。最后在酶标仪450 nm处测定吸光度（OD）值，重复3次，并绘制生长曲线。

1.6　流式细胞术检测细胞凋亡

将各组细胞培养至正常生长阶段，转染48 h后胰酶消化，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline, PBS）洗涤，1 000 r/min离心5 min，收集细胞；用预冷PBS重悬细胞1次，1 000 r/min离心5 min，洗涤细胞；加入300 μL Binding Buffer重悬细胞；再加入5 μL Annexin V-FITC混匀，避光，室温孵育15 min；加入5 μL PI染色5 min，补加200 μL Binding Buffer。用FlowJo 10分析细胞凋亡比率。

1.7　双荧光素酶报告基因结合位点

使用starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-206与UCA1、YAP1的靶向结合位点。将含UCA1序列连接至双荧光素酶载体pGL3，得到pGL3-UCA1-WT载体。同时，通过定点突变将结合位点突变（MUT），构建突变质粒pGL3-UCA1-MUT。同理，构建pGL3-YAP1-WT和pGL3-YAP1-MUT质粒载体。将HN13细胞接种于96孔板中24 h，当细胞融合到50%～70%时，分别将UCA1-WT或UCA1-MUT质粒（YAP1-WT或YAP1-MUT）与mimics NC或miR-206 mimics同时转染HN13细胞。用双荧光素酶报告基因检测系统测定48 h荧光素酶相对活性。分别验证UCA1、YAP1的结合位点。

1.8　Western blotting检测

将各组细胞培养至对数生长期并转染24 h，胰酶消化并收集细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤，用RIPA裂解液分离提取细胞样本中的全蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF膜上，浸入含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）中，室温下摇床封闭2 h。加入YAP1一抗（1∶1 000），4℃共同孵育8 h。PBS洗涤3次，加入相应二抗（1∶5 000），震荡孵育2 h。洗膜后，加入化学发光试剂显色、胶片曝光。使用凝胶成像分析系统拍照，通过Image J软件计算YAP1蛋白灰度值。

1.9　统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　各组细胞lncRNA UCA1、miR-206 mRNA相对表达量比较

qRT-PCR结果显示，HOK细胞lncRNA UCA1 mRNA相对表达量为（1.10±0.12）、TSCCA细胞为（1.98±0.23）、SCCl5细胞为（1.85±0.19）、HN13细胞为（3.02±0.18）、CAL27细胞为（2.32±0.15）、HSC3细胞为（1.97±0.18）、SCC9细胞为（2.59±0.15），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =37.580，P =0.000），TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9细胞均较HOK细胞升高（P <0.05）。

HOK细胞miR-206 mRNA相对表达量为（1.06±0.10）、TSCCA细胞为（0.31±0.09）、SCCl5细胞为（0.42±0.07）、HN13细胞为（0.26±0.05）、CAL27细胞为（0.38±0.08）、HSC3细胞为（0.41±0.04）、SCC9细胞为（0.40±0.13），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =32.070，P =0.000），TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9细胞均较HOK细胞降低（P <0.05）。其中HN13细胞miR-206 mRNA表达差异更显著，故选择该细胞株进行后续实验。

2.2　lncRNA UCA1促进OSCC细胞凋亡

qRT-PCR结果显示，对照组lncRNA UCA1相对表达量为（1.05±0.08）、控制组为（1.05±0.10）、实验组为（0.21±0.07），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =99.991，P =0.000）。对照组与控制组比较，差异无统计学意义（P >0.05）；对照组与实验组比较，差异有统计学意义（P <0.05），说明转染成功。

各组24 h、48 h、72 h和96 h的OD值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD值有差异（F =191.904，P =0.000）；②各组OD值有差异（F =27.801，P =0.000），实验组低于对照组；③各组的OD值变化趋势有差异（F =9.042，P =0.000）。表明敲除lncRNA UCA1使细胞活力明显降低。见表2。

表2  各组不同时间点OD值比较 （n =3， x±s）

组别	24 h	48 h	72 h	96 h
控制组	0.19±0.05	0.32±0.04	0.50±0.04	0.88±0.10
对照组	0.21±0.03	0.31±0.03	0.51±0.03	0.99±0.13
实验组	0.21±0.05	0.25±0.03	0.35±0.03	0.56±0.06

流式细胞术结果显示，控制组凋亡率为（4.14±0.94）%、对照组为（4.04±1.46）%、实验组为（14.96±1.59）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =64.221，P =0.000）。对照组与控制组差异无统计学意义（P >0.05），实验组凋亡率较对照组升高（P <0.05），敲除lncRNA UCA1诱导细胞凋亡。见图1。

图1  3组NH13细胞凋亡率比较

2.3　lncRNA UCA1能够靶向miR-206

通过starBase数据库预测lncRNA UCA1与miR-206存在结合位点，并构建了突变序列（见图2）。UCA1-WT转染miR-206 mimics荧光素相对活性为（0.48±0.08）、UCA1-MUT miR-206 mimics NC为（1.04±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t =7.849，P =0.001），UCA1-MUT转染miR-206 mimics荧光素相对活性为（1.02±0.11），UCA1-MUT转染mimics NC为（1.01±0.19），经t检验，差异无统计学意义（t =0.395，P =0.713），UCA1-WT荧光素酶相对活性被显著抑制（P <0.05），而UCA1-MUT荧光素酶相对活性无显著变化（P >0.05），证实两者间的靶向结合关系。

图2  lncRNA UCA1与miR-206的结合位点

将对照组均分为对照组1和对照组2，并分别转染siNC和过表达空载体；将实验组均分为实验组1和实验组2，实验组1和实验组2分别转染siUCA1和UCA1过表达载体。qRT-PCR结果显示，对照组1 miR-206相对表达量为（1.02±0.07）、实验组1为（2.34±0.23）、对照组2为（1.06±0.09）、实验组2为（0.22±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F =131.527，P =0.000），实验组1较对照组1升高（P <0.05），实验组2较对照组2降低（P <0.05）。

2.4　YAP1是miR-206的靶基因

通过starBase预测miR-206与YAP1存在结合位点，并构建了突变序列（见图3）。YAP1-WT转染miR-206 mimics荧光素相对活性为（0.42±0.07）、YAP1-MUT miR-206 mimics NC为（1.03±0.10），经t检验，差异有统计学意义（t =8.398，P =0.001），YAP1-MUT转染miR-206 mimics荧光素相对活性为（1.03±0.10），YAP1-MUT转染mimics NC为（1.04±0.15），经t检验，差异无统计学意义（t =0.365，P =0.733），YAP1-WT mimics荧光素酶活性被抑制（P <0.05），而YAP1-MUT mimics荧光素酶活性无显著变化（P >0.05），证实两者的靶向结合关系。

图3  miR-206与YAP1的结合位点

控制组不做任何处理，对照组1和对照组2分别转染mimics NC和inhibitor NC，实验组1和实验组2分别转染miR-206 mimics和inhibitor。qRT-PCR结果显示，对照组1的miR-206 mRNA相对表达量为（1.01±0.18）、对照组2为（1.04±0.21）、实验组1为（2.56±0.19）、实验组2为（0.22±0.08）、控制组为（1.05±0.10），经方差分析，差异有统计学意义（F =84.583，P =0.000）。对照组1、对照组2与控制组比较，差异无统计学意义（P >0.05），实验组1 miR-206 mRNA相对表达量较对照组1显著升高（P <0.05），实验组2较对照组2显著降低（P <0.05），提示miR-206 mimics和inhibitor细胞转染有效。另外，对照组1的YAP1 mRNA相对表达量为（1.08±0.18）、对照组2为（0.99±0.12）、实验组1为（0.47±0.06）、实验组2为（1.68±0.19）、控制组为（1.00±0.16），经方差分析，差异有统计学意义（F =25.662，P =0.000），实验组1较对照组1降低（P <0.05），实验组2较对照组2升高（P <0.05）。Western blotting检测结果显示，对照组1的YAP1蛋白相对表达量为（0.58±0.08）、对照组2为（0.59±0.05）、实验组1为（0.31±0.04）、实验组2为（0.84±0.06）、控制组为（0.59±0.09），经方差分析，差异有统计学意义（F =28.324，P =0.000），实验组1较对照组1降低（P <0.05），实验组2较对照组2升高（P <0.05）（见图4）。

图4  各组YAP1蛋白的表达

2.5　lncRNA UCA1通过miR-206/YAP1促进OSCC细胞的增殖并抑制凋亡

为进一步验证该信号机制，笔者在细胞中转染siUCA1的同时转染miR-206 inhibitor，对照组不做处理，实验组1转染siUCA1，实验组2转染siNC和miR-206 inhibitor的阴性对照，实验组3转染siUCA1和miR-206 inhibitor。对照组miR-206 mRNA相对表达量为（1.05±0.11）、实验组1为（2.45±0.15）、实验组2为（2.37±0.25）、实验组3为（1.16±0.12），经方差分析，差异有统计学意义（F =62.351，P =0.000），实验组1较对照组升高（P <0.05），促进了miR-206的表达；实验组3较实验组2降低，抑制了miR-206的表达（P <0.05）。对照组YAP1 mRNA相对表达量为（1.09±0.16）、实验组1为（0.45±0.07）、实验组2为（0.43±0.08）、实验组3为（0.96±0.13），经方差分析，差异有统计学意义（F =24.863，P =0.000），实验组1较对照组降低（P <0.05），抑制YAP1 mRNA的表达，实验组3较实验组2升高（P <0.05），恢复YAP1的表达。Western blotting检测结果显示，对照组YAP1蛋白相对表达量为（0.67±0.08）、实验组1为（0.42±0.06）、实验组2为（0.43±0.10）、实验组3为（0.74±0.10），经方差分析，差异有统计学意义（F =11.503，P =0.003），实验组1 YAP1蛋白相对表达量较对照组降低（P <0.05），抑制YAP1蛋白的表达，实验组3较实验组2升高，恢复了YAP1蛋白的表达（P <0.05）（见图5）。

图5  各组YAP1蛋白表达

各组24 h、48 h、72 h、96 h的OD值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD值有差异（F =232.034，P =0.000）；②各组的OD值有差异（F =24.691，P =0.000）；③各组的OD值变化趋势有差异（F =8.123，P =0.000）（见表3）。流式细胞术结果显示，对照组细胞凋亡率为（4.14±1.04）%、实验组1为（14.14±1.49）%、实验组2为（14.54±1.81）%、实验组3为（6.06±1.67）%，经方差分析，差异有统计学意义（F =37.312，P =0.000）。实验组1细胞凋亡率较对照组升高（P <0.05），实验组3较实验组2降低（P <0.05）（见图6）。

表3  各组不同时间点OD值比较 （n =3， x±s）

组别	24 h	48 h	72 h	96 h
对照组	0.19±0.05	0.32±0.03	0.52±0.06	0.93±0.06
实验组1	0.21±0.04	0.27±0.04	0.36±0.05①	0.58±0.06①
实验组2	0.21±0.04	0.25±0.03	0.35±0.07	0.56±0.10
实验组3	0.22±0.03	0.30±0.03	0.51±0.05②	0.86±0.08②

注 ：   ①与对照组比较，P <0.05； ②与实验组2比较，P <0.05。

图6  各组NH13细胞流式细胞图

3 讨论

近年来，越来越多的研究证实了lncRNAs通过调控细胞的增殖、分化、迁移侵袭等生物学进程参与癌症的进展^[10]。目前发现多种lncRNA在OSCC中表达有差异，lncRNA HOXA11-AS、lncRNA AC007271.3和lncRNA CASC9等在OSCC中高表达从而促进OSCC细胞增殖，抑制凋亡，加速OSCC的进展^[16-18]。现今lncRNA UCA1已经被报道在胶质母细胞瘤、膀胱癌、胃癌和前列腺癌等癌症中发挥致癌作用^[11-14]。而少有的几篇关于lncRNA UCA1在OSCC中的研究证实了其在OSCC中表达升高，并能够促进细胞增殖和增强耐药性^[15，19-20]。本研究结果与其一致，证实lncRNA UCA1在OSCC细胞中的表达水平显著高于人正常口腔角质细胞，通过抑制lncRNA UCA1表达能够显著阻碍细胞增殖并促进细胞凋亡。并且通过生物信息学预测结果与实验验证发现lncRNA UCA1通过miR-206/YAP1促进OSCC进展的分子机制，这是不同于先前报道的新发现。

miRNAs也是一种非编码RNA且高度保守，长度只有20～25个核苷酸，能通过与靶基因mRNA结合调控蛋白表达，参与多种细胞生物学过程^[21]。已有文献证实miRNAs能够参与各种疾病的进展，尤其是癌症^[22]。其中，miR-206在癌症中作为一种抑癌因子，通常抑制癌症进展，这已在非小细胞肺癌^[23]、前列腺癌^[24]、甲状腺癌^[25]和宫颈癌^[26]等研究中得到证实。目前关于miR-206在OSCC中的功能尚不清楚，而本研究证实miR-206在OSCC细胞中表达水平显著降低，其作为肿瘤抑制因子发挥作用，这与miR-206在其他癌症中的研究结果相一致。并且本研究结果证实miR-206能够与lncRNA UCA1互补结合，其表达被lncRNA UCA1调控，并进一步影响下游基因表达。而通过转染miR-206 inhibitor抑制miR-206的表达能够逆转siUCA1的功能，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。此外，本研究结果证实了miR-206是通过调控YAP1蛋白的表达水平实现对癌细胞生物学过程的调控。

YAP1表达水平升高往往促进癌症的进展，相关研究表明YAP1能够促进结直肠癌上皮间质转化和血管生成^[27]，在乳腺癌^[28]、甲状腺癌^[29]和胰腺导管癌^[30]中都具有促癌作用。有研究表明，YAP1同样也在OSCC中发挥了促癌作用，对其抑制能够显著抑制癌症进展^[31-33]，本研究结果与以上结果一致，YAP1能够促进OSCC细胞增殖，抑制凋亡。本研究还证实YAP1是miR-206的1个靶基因，其表达受到miR-206的调控，而lncRNA UCA1能够通过miR-206间接调控YAP1的表达，从而影响OSCC细胞的增殖、凋亡，参与OSCC的进展。本研究结果显示了敲除lncRNA UCA1后，YAP1蛋白表达水平显著下降，同时细胞活力显著降低，凋亡细胞显著增多。本研究通过敲除lncRNA UCA1在OSCC中的表达，证实了其促癌作用，并生物信息学预测结果和双荧光素酶验证了miR-206和lncRNA UCA1、YAP1间的靶向结合关系，进一步实验验证了三者在OSCC中的相互作用及对OSCC进展的影响。

综上所述，本研究阐明了lncRNA UCA1在OCSS中通过靶向miR-206调控YAP1的表达，介导OSCC细胞增殖和凋亡，这一分子机制的发现为OSCC的诊断和治疗提供了新思路。然而，鉴于lncRNAs的多功能靶向作用，lncRNA UCA1在OSCC中更详细的分子机制还有待进一步探索，对其在临床诊断治疗中的应用还需更多的研究和论证。