RasGRF1在结直肠癌细胞中的表达及其对癌细胞生物学行为的影响

摘要

目的

探究RasGRF1在结直肠癌细胞中的表达及对癌细胞生物学功能的影响。

方法

采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测不同结直肠癌细胞系DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15细胞中RasGRF1 mRNA；体外培养人结肠癌细胞，随机分为si-RasGRF1-NC组（阴性对照）、si-RasGRF1组（沉默RasGRF1表达）、NG组（空白对照）。采用qRT-PCR检测各组RasGRF1 mRNA，CCK-8法检测细胞存活情况，AnnexinV/PITC双染法检测细胞凋亡，Western blotting检测细胞PI3K/Akt通路蛋白。

结果

DiFi细胞中RasGRF1 mRNA相对表达量最高（P <0.05），选择DiFi细胞进行后续实验。si-RasGRF1组光密度值低于NG组、si-RasGRF1-NC组（P <0.05）。si-RasGRF1组细胞凋亡率高于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05）。si-RasGRF1组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量低于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05），Caspase-3蛋白相对表达量高于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05）。

结论

RasGRF1在结直肠癌细胞中异常高表达，抑制RasGRF1表达可抑制DiFi细胞增殖并诱导细胞凋亡，且该作用是通过抑制DiFi细胞PI3K/Akt通路活化来实现的。

关键词

结直肠癌; RasGRF1; 细胞; 增殖; 凋亡

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率及病死率呈逐年上升趋势，其发生、发展机制复杂，尚未明确。目前临床治疗结直肠癌主要通过手术及放化疗，由于其恶性程度高，患者5年生存率仅为50%左右^[1-2]。从基因层面探寻结直肠癌分子生物学治疗靶标以改善患者预后成为研究热点。RasGRF1是一种父系印记基因，位于人染色体25q15上，能够调控基因表达，参与肿瘤进展^[3]。何新等^[4]研究显示，抑制RasGRF1表达能够抑制人结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。目前RasGRF1对结直肠癌细胞生物学功能影响的具体机制尚未明确。隋华等^[5]研究显示，抑制PI3K/Akt通路活化，能够抑制结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，提高化疗敏感性。目前RasGRF1对结直肠癌细胞生物学功能的影响是否与调控PI3K/Akt通路有关少见报道，故本研究探究RasGRF1在结直肠癌细胞中的表达及对癌细胞生物学行为的影响，并分析其对PI3K/Akt通路的影响，以期为临床治疗结直肠癌提供一定参考。

1 材料与方法

1.1　细胞

人结直肠癌细胞系DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15细胞均由广东药学院实验室保存，购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2　主要试剂与仪器

DMEM-H培养基（北京伊塔生物科技有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（广州蕊特生物科技有限公司），Lipo-fectamine^TM 3000转染试剂盒（美国Invitrogen公司），si-RasGRF1、si-RasGRF1-NC序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，CCK-8试剂盒（深圳市纽邦生物技术有限公司），Annexin V/PITC双染试剂盒（上海复申生物科技有限公司），兔抗人Caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及β-actin多克隆抗体、山羊抗兔HRP二抗（武汉亚科因生物技术有限公司）。

二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo公司），C1000型实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（美国Bio-Rad公司），CytoFLEX SRT型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.3　方法

1.3.1　细胞培养

复苏并解冻DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15细胞，置于含10%灭活FBS＋DMEM-H的培养液，在37℃、5%二氧化碳₂、95%氧培养箱中培养，每2～3天换1次培养液，传代培养。

1.3.2　根据RasGRF1 mRNA相对表达量筛选细胞系

分别取1.3.1中对数生长期的各细胞，并提取总RNA、测浓度，逆转录为cDNA，进行qRT-PCR反应。总反应体系20 μL：ULtra SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向引物各2.0 μL、去离子纯化水4.0 μL。反应条件：95℃变性15 s，60℃退火60 s，共40个循环。熔解曲线：60℃至95℃，每15 秒升温0.3℃。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCt法计算各细胞RasGRF1 mRNA相对表达量。qRT-PCR引物序列见表1。

表1  引物设计

基因	引物序列	引物长度/bp
RasGRF1	正向： 5'-GTTCAGGAAGAGTGACACCA-3'	27
	反向： 5'-TTCTCCGCATCTCCATTCT-3'
β-actin	正向： 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'	161
	反向： 5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'

1.3.3　细胞分组及处理

1.3.2结果显示DiFi细胞RasGRF1 mRNA相对表达量最高，选其为研究对象。取对数生长期的DiFi细胞，按2.5×10⁴个/孔的密度接种于24孔板，待细胞融合至70%～80%，更换无FBS培养液，将细胞随机分为3组。用无FBS的培养液将Lipofectamine^TM 3000稀释并分别配制浓度为10 mmol/L的si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1，然后将等体积Lipofectamine^TM 3000分别与si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1混匀、静置，加入DiFi细胞中，分别作为si-RasGRF1-NC组（阴性对照）、si-RasGRF1组（沉默RasGRF1表达）。同时将未经转染的细胞设置为NG组（空白对照）。各组细胞继续培养24 h，倒置荧光显微镜下观察细胞荧光强度，每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.3.4　qRT-PCR检测RasGRF1 mRNA的表达

分别取各组DiFi细胞并提取总RNA、测浓度，参照1.3.2的方法，计算各组DiFi细胞RasGRF1 mRNA相对表达量。

1.3.5　CCK-8法检测细胞存活情况

分别取各组DiFi细胞，胰蛋白酶消化处理，将细胞按2.5×10⁴个/孔的密度接种于24孔板，培养24 h后加入CCK-8试剂，继续培养2 h，检测490 nm波长处各孔细胞光密度（optic density, OD）值，重复3次，严格按照CCK-8试剂盒说明书进行操作。统计各组细胞OD值，每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.3.6　AnnexinV/PITC双染法检测DiFi细胞凋亡

分别取各组DiFi细胞，PBS溶液洗涤，弃上清液，调整密度为1×10⁶个/mL的细胞悬液，取100 μL加入AnnexinV/PITC（5 μL）+PI（10 μL，20 μg/mL）混匀，孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组6个复孔，实验重复3次。

1.3.7　Western blotting检测细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路蛋白的表达

分别取各组DiFi细胞，以RIPA裂解并提取总蛋白，电泳、转膜，放入5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，分别加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3及内参β-actin作为一抗（1∶500稀释），4℃过夜，加入HRP标记山羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，显影、定影，计算目的蛋白相对表达量。

1.4　统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q 法。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　不同结直肠癌细胞系中RasGRF1 mRNA的表达

DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15细胞RasGRF1 mRNA相对表达量分别为（1.00±0.15）、（0.69±0.11）、（0.73±0.12）、（0.45±0.07），经方差分析，差异有统计学意义（F =222.059，P =0.005），DiFi细胞RasGRF1 mRNA相对表达量最高（P <0.05），选择DiFi细胞进行后续实验。

2.2　各组DiFi细胞RasGRF1 mRNA相对表达量比较

NG组、si-RasGRF1-NC组、si-RasGRF1组RasGRF1 mRNA相对表达量分别为（1.00±0.15）、（0.99±0.16）和（0.71±0.11），经方差分析，差异有统计学意义（F =324.568，P =0.000），si-RasGRF1组低于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05），说明DiFi细胞转染成功。

2.3　抑制RasGRF1表达对DiFi细胞存活能力的影响

NG组、si-RasGRF1-NC组、si-RasGRF1组DiFi细胞OD值分别为（0.87±0.15）、（0.85±0.13）和（0.37±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F =2 883.063，P =0.000），si-RasGRF1组低于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05）。

2.4　抑制RasGRF1表达对DiFi细胞凋亡的影响

NG组、si-RasGRF1-NC组、si-RasGRF1组DiFi细胞凋亡率分别为（9.15±1.38）%、（9.03±1.36）%和（25.78±3.87）%，经方差分析，差异有统计学意义（F =396.215，P =0.000），si-RasGRF1组高于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05）。见图1。

图1  各组DiFi细胞流式细胞图

NG组 si-RasGRF1-NC组 si-RasGRF1组

2.5　抑制RasGRF1表达对DiFi细胞PI3K/Akt通路蛋白的影响

NG组、si-RasGRF1-NC组、si-RasGRF1组DiFi细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果：si-RasGRF1组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量低于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05），Caspase-3蛋白相对表达量高于NG组和si-RasGRF1-NC组（P <0.05）。见表2和图2。

表2  各组DiFi细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相对表达量比较 （x±s）

组别	p-PI3K/PI3K	p-Akt/Akt	Caspase-3
NG组	1.08±0.17	1.15±0.18	0.36±0.06
si-RasGRF1-NC组	1.06±0.16	1.17±0.18	0.40±0.08
si-RasGRF1组	0.45±0.08†	0.51±0.08†	0.97±0.16†
F 值	324.015	331.5241	261.329
P 值	0.000	0.000	0.000

注 ：   †与NG组、si-RasGRF1-NC组比较，P <0.05。

图2  各组DiFi细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白的表达

3 讨论

结直肠癌是恶性程度较高的消化道肿瘤之一，发病率居全球恶性肿瘤的第三位，目前临床治疗仍以手术辅以放化疗为主，但未能取得较理想的疗效^[6]。RasGRF1是一种多结构域蛋白，能够调节肿瘤细胞生物学行为，参与肿瘤进展^[7]。聂文静等^[8]研究显示，RasGRF1在结直肠癌组织中异常高表达，作为促癌基因参与结直肠癌进展。文献报道，下调RasGRF1表达能对人结直肠癌细胞增殖发挥抑制作用，对细胞凋亡发挥促进作用^[4]。

肿瘤细胞增殖及凋亡失衡是肿瘤发生、发展的关键，其中Caspase-3是凋亡过程的关键执行者^[9-10]。本研究选择DiFi细胞进行研究，成功转染DiFi细胞，且结果显示，与NG组、si-RasGRF1-NC组比较，si-RasGRF1组DiFi细胞存活率降低，凋亡率升高。与既往研究结果一致，说明抑制RasGRF1表达能够抑制DiFi细胞增殖并诱导细胞凋亡。PI3K是PI3K/Akt信号通路的起始因子，其活化产生第二信使PIP3，进而磷酸化Akt蛋白的Thr308位点，促使Akt活化；而活化的Akt发生磷酸化，最终抑制下游靶基因Caspase-3的表达，从而抑制细胞凋亡^[11-13]。马家驰等^[14]研究显示，抑制PI3K/Akt通路活化能抑制结肠癌细胞增殖及转移。既往研究显示，上调RasGRF1表达能促进Ras-PI3K-Akt通路活化，参与肿瘤成纤维细胞增殖及分化^[15]。本研究结果显示，与NG组、si-RasGRF1-NC组比较，psi-RasGRF1组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量降低，Caspase-3蛋白相对表达量升高，说明抑制RasGRF1表达能抑制DiFi细胞增殖并诱导细胞凋亡，其作用可能是通过抑制PI3K/Akt通路活化来实现的。

综上所述，RasGRF1在人结直肠癌DiFi细胞中异常高表达。抑制RasGRF1表达可能抑制PI3K/Akt通路活化，从而抑制DiFi细胞增殖并诱导细胞凋亡。然而本实验未能明确RasGRF1对PI3K/Akt通路的具体调控作用，后期应进行深入研究。