NLR家族Pyrin域蛋白3炎症小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的作用及其机制研究

摘要

目的

探究含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）炎症小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的作用及其机制。

方法

将30只大鼠随机分为对照组、模型组、炎症小体抑制组，每组10只。除对照组外，采用高糖饲养+腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病模型，模型复制成功后用球钻毁损大鼠部分牙槽骨骨质，复制牙槽骨缺损模型。模型复制成功后，炎症小体抑制组大鼠立即尾静脉注射20 mg/kg NLRP3抑制剂，1次/d，连续给药28 d。给药结束后，检测各组大鼠空腹血糖。采用酶联免疫吸附试验测定各组大鼠血清护骨因子（OPG）和碱性磷酸酶（ALP）含量。分别采用苏木精-伊红（HE）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TARP）染色观察牙槽骨缺损愈合情况及破骨细胞数，进行骨再生Lane-Sandhu评分。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blotting检测NLRP3、Caspase-1和白细胞介素1β（IL-1β）mRNA和蛋白的表达。

结果

模型组OPG、ALP低于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。HE染色结果显示，模型组大鼠牙槽骨缺损严重，可见大量炎症浸润细胞，炎症小体抑制组牙槽骨缺损程度低，炎症浸润细胞较少。模型组Lane-Sandhu评分低于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。TARP染色结果显示，模型组破骨细胞数高于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。模型组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA和蛋白相对表达量高于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。

结论

抑制NLRP3炎症小体可改善骨代谢，促进糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合，其作用可能与抑制NLRP3/IL-1β通路有关。

关键词

糖尿病; 牙槽骨缺损; NLRP3炎症小体; Caspase-1; 白细胞介素1β; 大鼠

牙槽骨缺损是指上下颌骨边缘镶嵌牙根处因牙周炎、创伤或肿瘤等因素导致该处骨组织受损。牙槽骨受损严重时，牙周组织支持力量减弱，牙齿松动甚至脱落，因此牙槽骨缺损的修复对口腔疾病患者至关重要。临床上无机材料、复合材料和自体牙骨移植材料常被用来修复牙槽骨缺损^[1]。廖武堂^[2]研究结构显示，Bio-Oss骨粉结合猪小肠黏膜下层也可促进牙槽骨组织的再生，有效修复牙槽骨缺损。但很多牙槽骨缺损患者同时合并糖尿病，在高糖环境下，骨代谢紊乱^[3]，牙槽骨缺损难以愈合，因此糖尿病患者的牙槽骨缺损修复是口腔科面临的难点之一。目前，尚未有针对糖尿病患者牙槽骨缺损修复的有效方法。

NLR家族Pyrin域蛋白3（NOD-like receptor 3, NLRP3）在糖尿病病程中扮演着重要角色。既往研究显示，抑制NLRP3炎症小体可以加速糖尿病模型小鼠足部溃疡伤口的愈合^[4]，但目前暂未见研究报道NLRP3炎症小体的活性与糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的关系。因此本实验探究抑制NLRP3炎症小体糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合情况，以期为临床寻找治疗方案提供理论基础。

1 材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验动物

4月龄健康SD雄性大鼠30只，体重（220±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2019-0003。适应性饲养3 d，正常饮食、饮水。

1.1.2　主要试剂

链脲佐菌素（上海源叶生物科技有限公司），NLRP3、Caspase-1、白细胞介素1β（Interleukin, IL-1β）、β-actin兔抗大鼠一抗、HPR标记羊抗兔IgG二抗（美国Abcam公司），护骨因子（osteoprotegerin, OPG）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）ELISA试剂盒（上海瑞番生物科技有限公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase, TARP）染色试剂盒（上海一研生物科技有限公司），Hifair ^® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit试剂盒、Trieasy™ Total RNA Extraction Reagent TRIeasy™总RNA提取试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司），NLRP3炎症小体抑制剂（YQ128）、动物组织蛋白抽提试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），高糖饲料（上海锐赛生物技术有限公司）。

1.1.3　主要仪器

血糖仪BGM501（上海寰熙医疗器械有限公司），多样品组织研磨仪CEBO-24（上海测博生物科技发展中心），全自动酶标仪318C+（上海沛欧分析仪器有限公司），Qubit荧光定量仪、SimpliAmp PCR仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），80i显微镜（日本Nikon公司），一体式凝胶成像系统WD-9413D、转印电泳仪DYCZ-40K（北京六一生物科技有限公司）。

1.2　方法

1.2.1　糖尿病模型大鼠的复制

高糖饲料饲养4周后，大鼠腹腔注射0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠稀释的链脲佐菌素60 mg/kg。72 h后用一次性测血糖针刺破大鼠尾尖取血（测量前12 h禁食），用血糖仪检测血糖，血糖≥ 16.7 mmol/L为糖尿病模型复制成功^[5]。

将复制成功的糖尿病模型大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，分离口腔上颌两侧第一磨牙腭侧的牙龈与粘骨膜，用球钻缓慢由近中向远中磨除部分牙槽骨骨质，形成大小约2.0 mm×2.0 mm×1.0mm的缺口，磨除的同时注意用生理盐水冲洗冷却，缝合牙龈。

1.2.2　实验分组及给药

将30只大鼠随机分为对照组、模型组、炎症小体抑制组，每组10只。模型复制成功后，炎症小体抑制组大鼠立即尾静脉注射20 mg/kg NLRP3抑制剂（YQ128），1次/d，连续给药28 d。对照组和模型组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水，1次/d，连续注射28 d。

1.2.3　空腹血糖检测

给药结束后大鼠禁食12 h，用一次性测血糖针刺大鼠尾部取血，血糖仪测量各组大鼠空腹血糖。

1.2.4　骨代谢指标检测

测量血糖后，大鼠尾静脉采血，1 000 r/min离心10 min，取上清液采用ELISA检测OPG和ALP含量，严格按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪读数，将光密度值代入标准曲线计算相应孔位浓度。

1.2.5　牙槽骨缺损区苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色及Lane-Sandhu评分

采血后，处死各组大鼠，取左侧上颌骨复制缺损处的骨组织于多聚甲醛中固定24 h，然后置于100 g/L乙二胺四乙酸溶液中脱钙处理10周，每2天换脱钙液1次。脱钙后取出骨组织，常规脱水，石蜡包埋，蜡块切片约4 μm厚，进行HE染色，显微镜下观察牙槽骨愈合情况。根据Lane-Sandhu评分标准^[6]评价再生情况，包括：①骨形成。无骨形成计0分，骨形成占骨缺损> 0%～25%计1分，骨形成占骨缺损> 25%～50%计2分，骨形成占骨缺损> 50%～75%计3分，骨形成占骨缺损> 75%～100%计4分。②骨连接。骨折线清晰计0分，骨折线部分存在计1分，骨折线消失计2分。③骨塑形。未见塑形计0分，髓腔形成计为2分，皮质骨形成计4分。

1.2.6　TARP染色观察破骨细胞数

参照WU等^[7]检测方法，取1.2.5中石蜡切片，加入蒸馏水水化脱蜡，采用TARP染色试剂盒染色，盖好盖玻片，放入烘箱内烘干，用显微镜观察破骨细胞，每张切片随机选取6个视野进行破骨细胞计数（不规则长条形，胞浆呈红色），计算平均值。

1.2.7　实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表达

取大鼠右侧上颌骨复制缺损处的骨组织，剔除牙周软组织后放入盛有液氮的研钵中，研磨成粉末，取100 mg粉末于离心管中，加入裂解液，室温下裂解5 min后离心，严格按照试剂盒说明书进行操作。取5 μL提取好的mRNA，按照试剂盒添加其余组分，加无菌无酶水补至30 μL，放入qRT-PCR仪中。50℃、10 min将mRNA逆转录为cDNA，PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火30s，共45个循环。β-actin作为内参，根据Ct值计算2^-ΔΔCt。引物设计见表1。

表1  qRT-PCR引物序列

基因	引物序列	引物长度/bp
NLRP3	正向： 5'-GGTACATGGATAGCATGA-3'	18
	反向： 5'-TAGGACATAGACATTAGA-3'
Caspase-1	正向： 5'-TGTAGACATGAAACGTACAC-3'	20
	反向： 5'-GGAACAATACAGATCATTGA-3'
IL-1β	正向： 5'-GTTAGACATAGACATAGA-3'	18
	反向： 5'-TTGAACCTAACAGGTACT-3'
β-actin	正向： 5'-TTAGACATAGGATACCATAGAA-3'	22
	反向： 5'-TTAAAGACATAGACCATAGACA-3'

1.2.8　Western blotting检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达

取1.2.7中研磨好的骨组织粉末，在冰上加入蛋白提取试剂盒中的裂解液，于涡旋仪上混匀后离心，按照试剂盒说明书进行操作，采用BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE进行凝胶电泳，电泳结束后，浸泡于转膜液中将蛋白转移到PVDF转膜纸上，放入3%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，加入一抗室温下孵育过夜，洗膜，加入二抗孵育1 h，在凝胶成像系统中曝光观察，以β-actin作为内参计算灰度值。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 21.00统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t 检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　各组大鼠空腹血糖的比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠空腹血糖分别为（5.27±1.08）mmol/L、（18.74±4.17）mmol/L和（18.08±3.98）mmol/L，经方差分析，差异有统计学意义（F =5.008，P =0.014），与对照组比较，模型组与炎症小体抑制组空腹血糖均上升（P <0.05）。

2.2　各组大鼠骨代谢指标比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠OPG、ALP比较，经方差分析，差异有统计学意义（F =4.278和1.202，P =0.024和0.316），模型组OPG、ALP低于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。见表2。

表2  各组大鼠OPG和ALP含量比较 （n =10， x±s）

组别	OPG/（pmol/mL）	ALP/（u/L）
对照组	1.07±0.18	112.34±21.74
模型组	0.89±0.11①	98.74±18.62①
炎症小体抑制组	1.01±0.12②	108.64±20.36②
F 值	4.278	1.202
P 值	0.024	0.316

注 ：   ①与对照组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

2.3　各组大鼠牙槽骨HE染色及Lane-Sandhu评分比较

HE染色结果显示，模型组大鼠牙槽骨缺损严重，可见大量炎症浸润细胞，炎症小体抑制组牙槽骨缺损程度低，炎症浸润细胞较少。见图1。

图1  各组大鼠上颌骨组织　（HE染色×400）

对照组 模型组 炎症小体抑制组

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠Lane-Sandhu评分分别为（6.45±0.97）分、（3.98±0.61）分和（5.02±0.85）分，经方差分析，差异有统计学意义（F =22.666，P =0.000），模型组Lane-Sandhu评分低于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。

2.4　各组大鼠破骨细胞数比较

TARP染色结果显示，对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠破骨细胞数分别为（1.01±0.03）个/HP、（11.24±2.21）个/HP和（8.01±1.68）个/HP，经方差分析，差异有统计学意义（F =106.447，P =0.000），模型组破骨细胞数高于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。见图2。

图2  各组大鼠上颌骨组织　（TARP染色×200）

对照组 模型组 炎症小体抑制组

2.5　各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（F =13.175、18.414和23.672，P =0.001、0.000和0.000），模型组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量高于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。见表3。

表 3  各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较 （n =10， x±s）

组别	NLRP3 mRNA	Caspase-1 mRNA	IL-1β mRNA
对照组	0.21±0.05	0.22±0.04	0.17±0.06
模型组	0.59±0.19①	0.68±0.20①	0.56±0.14①
炎症小体抑制组	0.40±0.05①②	0.43±0.04①②	0.36±0.03①②
F 值	13.175	18.414	23.672
P 值	0.001	0.000	0.000

注 ：   ①与对照组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

2.6　各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F =14.121、12.333和10.932，P =0.001、0.000和0.002），模型组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量高于对照组和炎症小体抑制组（P <0.05）。见表4和图3。

表4  各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较 （n =10， x±s）

组别	NLRP3蛋白	Caspase-1蛋白	IL-1β蛋白
对照组	0.17±0.04	0.20±0.04	0.15±0.03
模型组	0.56±0.18①	0.62±0.21①	0.49±0.18①
炎症小体抑制组	0.36±0.08①②	0.39±0.09①②	0.31±0.08①②
F 值	14.121	12.333	10.932
P 值	0.001	0.001	0.002

注 ：   ①与对照组比较，P <0.05； ②与模型组比较，P <0.05。

图3  各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达

3 讨论

牙槽骨位于上下颌骨边缘处镶嵌牙龈的位置，是上下颌骨的牙槽突出部分。一般情况下，随着年龄的增长及牙齿的不断咀嚼挤压会导致牙槽骨不断吸收，高度下降；另外，在牙周炎等一些病理或外力的作用下，也会导致牙槽骨的缺损^[8]。纳米羟基磷灰石、类骨质羟磷灰石等材料已经广泛应用于人工修复牙槽骨缺损中^[9]。但临床治疗中发现，牙槽骨缺损糖尿病患者接受治疗后，高血糖导致骨愈合缓慢甚至出现不愈合，造成人工修复失败，患者面临失牙风险。有研究显示，炎症因子在糖尿病大鼠骨折愈合中发挥重要作用^[10]，NLRP3炎症小体是各种炎症反应的重要部分^[11]，因此探究抑制NLRP3炎症小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的影响具有重要的临床意义。

牙槽骨缺损愈合过程也就是局部骨重建的过程，即破骨细胞释放酸液溶解旧骨，成骨细胞分泌骨胶原形成新骨，两种作用保持动态的平衡^[12]，但糖尿病会引起患者机体骨代谢紊乱^[13]，破骨细胞被激活，成骨细胞受到抑制，导致骨愈合受阻，牙槽骨缺损难以愈合。OPG和ALP是典型的骨形成标志^[14-15]，OPG又被称为破骨细胞分化因子。有研究显示，抑制OPG的活性会降低破骨细胞的分化程度^[16]。ALP则广泛分布在机体各个组织中，成骨细胞的增殖分化会分泌ALP。本研究结果显示，NLRP3炎症小体抑制组大鼠血清OPG与ALP出现不同程度的升高，说明抑制NLRP3炎症小体可以促进成骨细胞的增殖与分化，抑制破骨细胞活性。通过HE染色发现，模型组大鼠牙槽骨缺损严重，且炎症浸润细胞较多，但NLRP3炎症小体抑制组牙槽骨缺损程度降低，并且炎症浸润细胞较少。并且与模型组比较，炎症小体抑制组骨再生Lane-Sandhu评分升高，提示该组骨形成程度较高。TARP特异性地分布在破骨细胞中，因此TARP染色是检测骨组织中破骨细胞的常见方法，染色后破骨细胞呈红色。本研究结果表明，相比模型组，炎症小体抑制组破骨细胞数减少。既往研究显示，激活NLRP3炎症小体活性后，关节组织中的破骨细胞数量上升^[17]。

炎症参与糖尿病病程，并且影响骨代谢过程。李石岩等^[18]研究发现，抑制NLRP3活性可以促进骨缺损的修复。NOD样受体（NOD-like receptor，NLRs）参与机体固有免疫，NLRP3是NLRs的主要成员之一，在糖尿病状态下其表达上调。NLRP3可以识别刺激信号并活化形成NLRP3炎症小体。NLRP炎症小体会进一步刺激下游Caspase-1，活化的Caspase-1刺激pro-IL-1β，形成炎症因子IL-1β。本研究结果显示，与对照组相比，模型组NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA和蛋白相对表达量升高，NLRP3炎症小体被抑制后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA和蛋白相对表达量降低。

因此，抑制NLRP3炎症小体可以抑制NLRP3/IL-1β通路活化，促进成骨细胞的增殖与分化，抑制破骨细胞活性，从而促进糖尿病大鼠牙槽骨缺损的愈合。