摘要
选取SPF级Wistar大鼠49只，复制轻型颅脑损伤大鼠模型。7只为空白对照组，42只为模型组；模型组分别于模型复制成功后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天取材。采用苏木精-伊红（HE）染色、尼氏染色、铀铅双染法观察大鼠海马神经元微观结构的变化；Western blotting检测各组大鼠海马B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、铁蛋白重链（FTH）、天冬氨酸-胱氨酸特异性蛋白酶家族1（Caspase-1）蛋白表达。
光学显微镜可见，模型组有神经元皱缩等现象。电镜及Western blotting结果显示，与空白对照组比较，模型组第1天神经元细胞轻度固缩，Bcl-2蛋白相对表达量较高（P <0.05）；模型组第3天、第7天的细胞膜多处破损，细胞器部分肿胀；模型组第3天的Caspase-1蛋白相对表达量达到最高峰（P <0.05）；模型组第14天的神经元线粒体嵴多局部断裂，FTH蛋白相对表达量也较高（P <0.05）；模型组第28天的FTH蛋白相对表达量仍在升高（P <0.05）；模型组第28天胞内可见少量初级溶酶体或自噬溶酶体，但模型组第28天的LC3B蛋白相对表达量较模型组第21天降低（P <0.05）。
全球每年有1/1 000的人患有轻型颅脑损
49只SPF级Wistar大鼠，体重（180±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2021-0011。饲养于山西中医药大学动物房，温度（22±2）℃，湿度（50±5）％，自然昼夜节律，自由进水进食；实验动物使用许可证号：SYXK（晋）2020-0006。
苏木精-伊红（HE）染色液（CR2203235）、1％甲苯胺蓝染液（CR2206091）、电镜固定液（CR2211123）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司，B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma 2, BCL-2）基因（4000000173）、铁蛋白重链（ferritin heavy chain, FTH）（4000000023）、β-肌动蛋白（β-actin）（910026004）均购自武汉爱博泰克（ABclonal）生物科技有限公司，微管相关蛋白1轻链3B（microtubule associated protein light chain 3B, LC3B）（F074504）购自上海泊湾生物技术有限公司，天冬氨酸-胱氨酸特异性蛋白酶家族1 P20（aspartate-cystine specific protease family-1-P20, Caspase-1-P20）（13A90②）、HRP-羊抗兔IgG（BST15D07AE54）均购自中国博士德公司。
KDC－160HR型台式高速冷冻离心机购自安徽中佳公司，HT7800型透射电子显微镜、透射电子显微镜成像系统购自日本日立公司，NIKON ECLIPSE E100正置光学显微镜、NIKON DS-U3成像系统购自日本尼康公司，Image Quant LAS 500型化学发光成像仪、Image-Pro Plus 6.0图像分析软件购自美国Alpha Innotech公司，R50型0呼吸麻醉机购自中国RWD公司，组织研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司，自制击打仪。
大鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法分为空白对照组（7只）及模型组（42只）。模型组大鼠经R50型0呼吸麻醉机麻醉后，按照MYCHASIUK
取材前禁食12 h，于次日1％戊巴比妥钠过量注射致死。空白对照组大鼠于模型复制成功24 h后取其中3只行心脏灌注，取大鼠全脑，放入4%预冷的多聚甲醛中固定12 h，备行HE染色、尼氏染色；并取1只大鼠2 mm×2 mm的海马组织，放入2.5％戊二醛固定液中，4 ℃保存，备做透射电镜；余下3只在冰上分离海马，置入-80 ℃冷冻保存备用行Western blotting检测。模型组分别于模型复制成功后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天各取7只大鼠，各时间段取材部位、方法与空白对照组相同。
取各组大鼠海马组织固定于4%预冷的多聚甲醛中12 h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，石蜡包埋。石蜡凝固后将组织切成5 μm厚的切片，石蜡切片于60 ℃烘箱脱蜡后，经二甲苯浸洗、酒精梯度复水、HE染色，中性树胶封片，通过正置光学显微镜成像系统采集切片图像，每张切片选取5个400倍脑组织视野图片，比较各组大鼠脑组织神经元损伤程度。
取制好的石蜡切片，于60 ℃烘箱脱蜡后，经二甲苯浸洗、酒精梯度复水、使用1%甲苯胺蓝溶液常温尼氏染色15 min，脱水，蜡化，中性树胶封片。正置光学显微镜下观察海马神经元尼氏体的变化，并用Image J软件统计海马CA1区3张不同位置的神经元吸光度值的变化。
取各组大鼠2 mm×2 mm的海马组织，放入电镜固定液中。1％锇酸固定，梯度乙醇脱水，依次在环氧丙烷与Epon812包埋混合液、37 ℃纯Epon812包埋液、100 ℃包埋剂中浸泡；后用醋酸铀染液、枸橼酸铅染液浸染；采用HT7800型透射电子显微镜及成像系统观察海马组织神经元超微结构的变化。
取-80 ℃冷冻保存的海马组织，用组织研磨仪研磨，取上清液，使用高速冷冻离心机提取总蛋白溶液，BCA法测定蛋白浓度，后配蛋白上样缓冲液，上样、电泳、转膜、封闭。分别加入β-actin（1∶30 000）、Bcl-2一抗（1∶1 000）、LC3B一抗（1∶2 000）、FTH一抗（1∶1 000）、Caspase-1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日，滴加HRP-羊抗兔孵育1 h，洗膜，使用化学发光成像仪进行ECL显影，曝光。Image Pro Plus 6.0图像分析软件分析目的蛋白灰度值。
空白对照组大鼠海马神经元CA1区锥体细胞数量丰富，排列整齐紧密，形态结构正常，胞质胞核分界清晰，染色均一。模型组第1天的皮层与海马体CA1区、CA4区、DG区均可见神经元皱缩，细胞染色加深，细胞排列不规则，胞核胞质分界不清，皮层皱缩神经元数量较多。模型组第3天的皮层与海马体CA1、DG区可见大量锥体细胞胞核皱缩深染，胞核胞质分界不清。模型组第7天的皮层与海马体CA1区可见大量神经元皱缩，细胞染色加深，部分胞核胞质分界不清，神经纤维排列疏松。模型组第3天、第7天的海马CA1区神经元数量较第1天减少，锥体细胞核皱缩深染逐渐增多，细胞排列不规则现象明显加重。模型组第14天神经元排列紊乱，细胞间隙增大，DG区有明显核固缩现象。模型组第21天的皮层和海马CA1区、DG区有少量核固缩现象，胞核胞质分界不清。模型组第28天的海马神经元锥体细胞数量较为丰富，排列较整齐，CA1区和DG区有少量核固缩现象。模型组第14天、第28天较模型组第1天的神经元数量明显增多，神经元皱缩现象减少，脑组织结构好转。见
图1 各组大鼠海马神经元CA1区随时间的动态变化 （HE×400）
空白对照组海马神经元尼氏体呈均匀深蓝色，尼氏体丰富；模型组第1天的CA1区呈淡蓝色，尼氏小体明显减少，椎体细胞多数核溶解消失、数量减少、间距增大、排列紊乱；模型组第3天的CA1区呈浅蓝色，尼氏小体减少，椎体细胞排列紊乱；模型组第7天的CA1区存在部分尼氏小体，细胞数量减少，排列紊乱；模型组第14天存在部分尼氏小体，部分区域核溶解消失；模型组第21天小部分尼氏体深染，小部分区域核溶解消失；模型组第28天尼氏体均匀淡蓝色，细胞数量较多，胞核胞质清晰可见。见
图2 各组大鼠海马神经元CA1区尼氏体的动态变化 （尼氏染色×400）
空白对照组、模型组第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天的海马神经元尼氏小体吸光度值分别为（0.12±0.02）、（0.08±0.01）、（0.08±0.01）、（0.08±0.01）、（0.08±0.01）、（0.09±0.01）、（0.11±0.01），各组比较，经方差分析，差异有统计学意义（F =11.570，P =0.000）。模型组第28天与空白对照组的尼氏小体吸光度值比较，差异无统计学意义（P >0.05）；其余模型组各时间段与空白对照组比较，吸光度值下降（P <0.05），尼氏小体含量下降，颜色变浅，少量神经元发生变性、坏死。见
图3 各组大鼠海马神经元尼氏体的吸光度值比较
1：空白对照组； 2：模型组第1天； 3：模型组第3天； 4：模型组第7天； 5：模型组第14天； 6：模型组第21天； 7：模型组第28天。† 与模型组第28天比较，P <0.05。
空白对照组神经元细胞核大而圆，染色质均匀，核膜清晰，细胞器丰富、肿胀较轻。模型组第1天的神经元细胞轻度固缩，细胞膜完整，细胞器肿胀，细胞核固缩，核周隙未见明显增宽；线粒体大多明显肿胀，基质溶解，嵴断裂、减少，空泡变；粗面内质网轻度扩张，表面核糖体较多脱颗粒，可见少量自噬溶酶体。模型组第3天的神经元损伤严重，细胞膜崩解，细胞基质局部紊乱，细胞核核膜完整，染色质轻度皱缩，线粒体轻度肿胀，基质变浅，粗面内质网中度扩张，可见少量自噬溶酶体。模型组第7天的神经元中重度水肿，细胞膜局部破损，细胞核核膜完整，染色质分布均匀，细胞器明显肿胀，大面积低电子密度水肿区，细胞器明显肿胀，基质溶解，嵴大量断裂、缺失，部分空泡变，粗面内质网少量脱颗粒，未见明显自噬；模型组第14天的神经元细胞膜完整，线粒体呈明显肿胀，线粒体嵴大量断裂、缺失，呈空泡变，内质网、高尔基体未见明显肿胀，未见明显自噬；因模型组第21天样本自溶，无法展现；模型组第28天的神经元细胞呈轻度损伤，细胞膜完整，细胞核染色质均匀，核仁较小，细胞器轻度肿胀，线粒体、粗面内质网轻度扩张，微体个别存在，胞内可见少量次级溶酶体和自噬溶酶体。见
图4 各组大鼠海马神经元超微结构的动态变化 （铀铅双染法×400）
各组大鼠海马体Bcl-2、LC3B、FTH、Caspase-1蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P <0.05）。与空白对照组比较，模型组第1天的Bcl-2蛋白相对表达量显著增高（P <0.05），模型组第3天、模型组第7天、模型组第14天、模型组第21天的Bcl-2蛋白相对表达量显著下降（P <0.05），其中模型组第3天下降最明显；模型组第28天的Bcl-2蛋白相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P >0.05）。与空白对照组比较，模型组LC3B蛋白相对表达量升高（P <0.05），且模型组第21天达到高峰，模型组第28天略有下降（P <0.05）。与空白对照组比较，模型组第1天、模型组第3天、模型组第7天、模型组第14天、模型组第21天、模型组第28天的FTH蛋白相对表达量升高（P <0.05），且模型组第28天高于模型组第21天（P <0.05）；与空白对照组比较，模型组第1天、模型组第3天、模型组第7天、模型组第14天、模型组第21天、模型组第28天的Caspase-1蛋白相对表达量升高（P <0.05），且模型组第3天达最高峰，虽然模型组第14天高于模型组第7天（P <0.05），但总体来讲，72 h后，Caspase-1表达水平均呈下降趋势。见
| 组别 | Bcl-2 | LC3B | FTH | Caspase-1 |
|---|---|---|---|---|
| 空白对照组 | 1.00±0.04 | 1.00±0.04 | 1.00±0.07 | 1.00±0.02 |
| 模型组第1天 | 2.57±0.12 | 1.16±0.05 | 1.78±0.08 | 1.50±0.06 |
| 模型组第3天 | 1.47±0.05 | 1.36±0.02 | 1.68±0.02 | 2.02±0.07 |
| 模型组第7天 | 1.44±0.12 | 1.43±0.06 | 3.31±0.11 | 1.50±0.04 |
| 模型组第14天 | 1.50±0.01 | 2.28±0.02 | 4.99±0.01 | 1.94±0.02 |
| 模型组第21天 | 1.40±0.03 | 2.50±0.08 | 5.57±0.13 | 1.73±0.05 |
| 模型组第28天 | 1.07±0.02 | 1.89±0.04 | 6.19±0.14 | 1.79±0.04 |
| F 值 | 170.700 | 413.000 | 1 549.000 | 166.000 |
| P 值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
图5 各组大鼠海马组织Bcl-2、LC3B、FTH、Caspase-1蛋白表达
1：空白对照组； 2：模型组第1天； 3：模型组第3天； 4：模型组第7天； 5：模型组第14天； 6：模型组第21天； 7：模型组第28天。
据报道，我国每年有77～89万例颅脑损伤新发病
凋亡存在于正常的神经细胞发育和生存中，是程序性细胞死亡方式的主要形
研究表明，颅脑损伤后3.5 h LC3开始升
有文献报道，中度坐骨神经慢性压迫性损伤模型复制成功72 h后，在受伤的皮层中观察到线粒体体积减小，且转铁蛋白、ROS等蛋白水平达到峰值，第7天恢复正
中枢神经系统损伤的主要生物学机制之一是神经炎症，这是治疗中枢神经系统损伤的关键切入
综上所述，影响细胞选择死亡方式的因素并不是单一维度的，在不同或同种条件下引起的能源竞争会引导细胞走向不同的死亡结局。由本研究结果可知，较多神经元细胞依旧在损伤后第一时间选择凋亡，焦亡紧随其后，铁死亡较晚发生，自噬持续性进行。
参 考 文 献
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