杆状病毒凋亡抑制蛋白5和胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9表达水平对尖锐湿疣患者的诊断价值

摘要

目的

探讨杆状病毒凋亡抑制蛋白5（BIRC5）和胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（CASP9）表达水平对尖锐湿疣（CA）患者的诊断价值。

方法

选取2021年9月—2023年10月在河北北方学院附属第一医院就诊的78例CA患者作为CA组，另选取同期该院50例皮肤健康者作为对照组。比较各组皮损组织BIRC5、CASP9相对表达量，分析两者表达水平与CA患者临床病理参数的关系。采用Spearman法分析CA患者皮损组织BIRC5与CASP9表达水平的相关性。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估皮损组织BIRC5、CASP9表达水平对CA的诊断效能。

结果

CA组皮损组织BIRC5相对表达量高于对照组（P <0.05），CASP9相对表达量低于对照组（P <0.05）。HPV混合感染患者皮损组织BIRC5相对表达量高于HPV单一型感染患者（P <0.05），CASP9相对表达量低于HPV单一型感染患者（P <0.05）；疣体团体直径≥ 10 mm患者皮损组织BIRC5相对表达量高于疣体团体直径< 10 mm患者（P <0.05），CASP9相对表达量低于疣体团体直径< 10 mm患者（P <0.05）；病程≥ 3个月患者皮损组织BIRC5相对表达量高于病程< 3个月患者（P <0.05），CASP9相对表达量低于病程< 3个月患者（P <0.05）。不同性别、年龄、BMI、皮损部位、疣体数目患者BIRC5、CASP9相对表达量比较，差异均无统计学意义（P >0.05）。Spearman相关性分析结果显示，CA患者皮损组织中BIRC5与CASP9表达呈负相关（r_s =-0.344，P <0.05）。皮损组织中BIRC5、CASP9表达水平诊断CA的曲线下面积分别为0.872（95% CI：0.813，0.932）、0.935（95% CI：0.893，0.977），敏感性分别为85.9%（95% CI：0.762，0.927）、92.3%（95% CI：0.840，0.971），特异性分别为72.0%（95% CI：0.575，0.838）、84.0%（95% CI：0.709，0.928）。BIRC5、CASP9表达水平联合诊断CA的曲线下面积为0.974（95% CI：0.950，0.997），敏感性、特异性分别为91.0%（95% CI：0.824，0.963）、94.0%（95% CI：0.835，0.987）。

结论

BIRC5、CASP9联合使用诊断CA效果显著，BIRC5和CASP9可以作为诊断CA的有效生物标志物，有助于提升诊断的准确性和效率。

关键词

尖锐湿疣; 杆状病毒凋亡抑制蛋白5; 胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9; 诊断

尖锐湿疣（condyloma acuminatum, CA）是一种由人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染引起的常见性传播疾病^[1]。其特点是在皮肤和黏膜上形成疣样增生，严重影响患者的生活质量^[2]。CA的诊断主要依靠临床表现，但由于早期病变可能较小，不易察觉，因此寻找有效的生物标志物对于提高诊断准确性具有重要意义。随着分子生物学和蛋白质组学的发展，研究者开始关注不同蛋白质在CA发病过程中的作用。杆状病毒凋亡抑制蛋白5（baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5, BIRC5）和胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteine-aspartic acid protease 9, CASP9）是在许多肿瘤和病毒性疾病中表达改变的蛋白^[3-6]。BIRC5作为一种抑制细胞凋亡的蛋白，与多种疾病的发生、发展相关；而CASP9则参与了细胞凋亡的关键途径，其表达变化可能影响病理状态。但两种蛋白在CA诊断中的应用价值尚未得到充分研究。本研究旨在探讨CA患者皮损组织BIRC5、CASP9相对表达量，并评估其作为生物标志物在CA诊断中的应用价值。通过比较CA患者与健康人群的表达差异，分析这些蛋白与临床病理特征的关系，为CA的诊断和治疗提供新的科学依据。

1 资料与方法

1.1　一般资料

选取2021年9月—2023年10月在河北北方学院附属第一医院就诊的78例CA患者作为CA组，另选取同期本院50例皮肤健康者作为对照组。纳入标准：①符合《尖锐湿疣诊疗指南（2014）》^[7]中CA的诊断标准；②未接受过任何针对CA的治疗，或已经停止相关治疗> 3个月；③患者自愿参加研究，并签署知情同意书；④年龄> 18岁。排除标准：①有其他皮肤病或性病；②妊娠期或哺乳期妇女；③有严重的心脏、肝脏、肾脏或其他重要器官功能障碍；④参与过其他临床试验，影响本研究结果评估；⑤有免疫系统疾病；⑥有精神疾病。两组患者性别构成、年龄、体质量指数（body mass index, BMI）比较，经χ² / t 检验，差异均无统计学意义（P >0.05），有可比性。本研究已获本院医学伦理委员会的审查和批准。见表1。

表1  两组患者一般资料比较

组别	n	男/女/例	年龄/（岁，x±s）	BMI/（kg/m2，x±s）
CA组	78	42/36	39.18±7.83	23.14±2.45
对照组	50	29/21	41.10±6.51	22.49±2.29
χ2 / t 值		0.213	1.443	1.502
P 值		0.645	0.152	0.136

1.2　方法

1.2.1　样品采集

CA组采集接受疣体切除手术患者的皮损组织样本。正常组男性采集包皮环切术时获取的健康包皮组织；女性采集外阴整形手术中切除的外阴组织样本。所有组织样本小心置于无菌管，保存在-80 ℃冰箱中以维持其稳定性。

1.2.2　检测皮损组织BIRC5、CASP9表达水平

①总RNA提取：使用TRIzol试剂盒（美国英杰生命技术有限公司）提取采集样品的RNA，严格按照试剂盒说明进行操作。②RNA纯化和浓缩：通过乙醇沉淀法对提取的RNA进行纯化和浓缩。然后，使用无RNase水溶解RNA，以保证RNA的纯度和完整性。③实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）：使用逆转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）将提取的RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix和特异性的BIRC5、CASP9引物对cDNA进行qRT-PCR。在实时PCR仪器（美国赛默飞世尔科技公司，Applied Biosystems 7900HT）上进行扩增，BIRC5正向引物：5'-ATTCGTCCGGTTGCGCTTTTCC-3'，反向引物：5'-CACGGCGCACTTTTCTTTCGCA-3'，长度均22 bp；CASP9正向引物：5'-ACACCCAGACCAGTGGACATGTTTT-3'，反向引物：5'-ATGTCCACTGGTCTGGGTGTGCGGTG-3'，长度分别为25和26 bp；GAPDH正向引物：5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，反向引物：5'-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3'，长度分别为20和21 bp。反应条件：反应体系总量为20 μL，包括2 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green PCR Master Mix、0.5 μL正向引物（10 μmol/L）、0.5 μL反向引物（10 μmol/L）及7 μL无RNase水。扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环。扩增结束后进行熔解曲线分析，温度为60～95 ℃，每步升温0.5 ℃，每步5 s。通过2^-ΔΔCt法计算BIRC5、CASP9相对表达量。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用t 检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ²检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　两组皮损组织中BIRC5、CASP9相对表达量比较

两组皮损组织中BIRC5、CASP9相对表达量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P <0.05），CA组皮损组织BIRC5相对表达量高于对照组，CASP9相对表达量低于对照组。见表2。

表2  两组皮损组织中BIRC5和CASP9相对表达量比较 （x±s）

组别	n	BIRC5	CASP9
CA组	78	1.89±0.41	0.60±0.19
对照组	50	1.28±0.34	1.05±0.22
t 值		8.762	12.285
P 值		0.000	0.0000

2.2　不同临床病理特征的皮损组织中BIRC5、CASP9相对表达量比较

不同病程、疣体团块直径、HPV感染类型患者BIRC5、CASP9相对表达量比较，经t 检验，差异均有统计学意义（P <0.05）。HPV混合感染患者皮损组织BIRC5相对表达量高于HPV单一型感染患者，CASP9相对表达量低于HPV单一型感染患者；疣体团体直径≥10 mm患者皮损组织BIRC5相对表达量高于疣体团体直径< 10 mm患者，CASP9相对表达量低于疣体团体直径< 10 mm患者；病程≥ 3个月患者皮损组织BIRC5 相对表达量高于病程< 3个月患者，CASP9相对表达量低于病程< 3个月患者。不同性别、年龄、BMI、皮损部位、疣体数目患者BIRC5、CASP9相对表达量比较，经t 检验，差异均无统计学意义（P >0.05）。见表3。

表3  不同临床病理特征的皮损组织中BIRC5、CASP9相对表达量比较 （x±s）

2.3　BIRC5表达与CASP9表达水平相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，CA患者皮损组织中BIRC5与CASP9表达呈负相关（r_s =-0.344，P =0.002）。见图1。

图1  BIRC5与CASP9表达水平相关性分析散点图

2.4　BIRC5和CASP9表达诊断CA的效能分析

皮损组织中BIRC5、CASP9表达水平诊断CA的曲线下面积分别为0.872（95% CI：0.813，0.932）、0.935（95% CI：0.893，0.977），敏感性分别为85.9%（95% CI：0.762，0.927）、92.3%（95% CI：0.840，0.971），特异性分别为72.0%（95% CI：0.575，0.838）、84.0%（95% CI：0.709，0.928）。BIRC5、CASP9表达水平联合诊断CA的曲线下面积为0.974（95% CI：0.950，0.997），敏感性、特异性分别为91.0%（95% CI：0.824，0.963）、94.0%（95% CI：0.835，0.987）。见表4和图2。

表4  BIRC5和CASP9表达水平对CA的诊断效能

指标	截断值	敏感性/%	95% CI		特异性/%	95% CI		曲线下面积	95% CI
			下限	上限		下限	上限		下限	上限
BIRC5	1.475	85.9	0.762	0.927	72.0	0.575	0.838	0.872	0.813	0.932
CASP9	0.845	92.3	0.840	0.971	84.0	0.709	0.928	0.935	0.893	0.977
联合	-	91.0	0.824	0.963	94.0	0.835	0.987	0.974	0.950	0.997

图2  BIRC5、CASP9诊断CA的ROC曲线

3 讨论

CA是一种由HPV引起的性传播疾病。HPV有多个亚型，特定亚型与CA的发病密切相关^[8]。CA主要通过性接触传播，也可能通过皮肤接触或使用受污染的物品传播。临床上CA通常表现为生殖器和肛周区域的单个或多个软质、湿润、粉红色或肤色的小丘疹或乳头状突起。这些病变有时隐匿，不易察觉，治疗后还有较高的复发率^[9]。CA对患者的健康和生活质量有多方面的危害。首先，其不仅影响外生殖器、肛门等部位的外观，还可能导致瘙痒、疼痛、出血等不适症状，严重者可引起继发感染^[10-12]。其次，CA即使经过治疗，患者仍面临反复发作的风险，给心理和情感造成压力^[13-14]。更为严重的是，若感染高危型HPV，若长期得不到控制，可能增加宫颈癌、肛门癌、阴茎癌等恶性肿瘤的风险^[15]。此外，CA是性传播疾病，未经及时诊治会增加伴侣感染的概率，并且可能通过母婴传播影响新生儿健康。鉴于CA早期病变不明显且易与其他皮肤病变混淆^[16-18]，快速准确的诊断对治疗和预防传播至关重要。

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，科研人员越来越多地将研究重点放在寻找能够准确诊断CA的生物标志物上。BIRC5是细胞凋亡抑制蛋白家族的一员，其在细胞分裂过程中扮演着重要角色，并且与肿瘤的发生、发展密切相关。BIRC5具有促进细胞存活、抑制凋亡和调节细胞周期的多重功能^[19-20]。而CASP9是细胞凋亡过程中的关键执行者，是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成员，主要参与细胞凋亡的内源性途径。CASP9在受到细胞内应激信号如DNA损伤时被激活，进而引发一系列下游反应，导致细胞凋亡^[21]。BIRC5和CASP9在病理状态下的表达变化显著，是诊断和治疗多种疾病的重要生物标志物^[22-26]。这两种蛋白在CA发病中的作用及其作为潜在诊断标志物的价值，正是当前研究的热点。鉴于CA的复杂性和对准确诊断的迫切需求，探索新的生物标志物具有重要的临床意义。本研究的目的在于评估BIRC5、CASP9在CA患者皮损组织中的表达水平，并探讨其作为CA诊断生物标志物的潜力。

本研究结果发现，CA组皮损组织中BIRC5相对表达量高于对照组，而CASP9相对表达量则低于对照组。这表明BIRC5和CASP9在CA患者的病变组织中表达失衡，与健康人群存在显著差异。此外，当CA患者有HPV混合感染、疣体直径≥10 mm或病程≥3个月时，BIRC5表达更高，而CASP9表达则更低。这些发现表明BIRC5和CASP9的表达水平与CA的严重程度相关。Spearman相关性分析揭示了CA患者皮损组织中BIRC5与CASP9表达水平呈负相关，表明两者可能相互作用，共同影响CA的发展。此外，皮损组织中BIRC5和CASP9的表达水平对于诊断CA具有重要价值。ROC曲线分析显示，BIRC5和CASP9的曲线下面积分别为0.872和0.935，截断值分别为1.475和0.845，敏感性分别为85.9%和92.3%，特异性分别为72.0%和84.0%。当BIRC5和CASP9联合诊断时，曲线下面积提高至0.974，敏感性和特异性分别达到91.0%和94.0%。这些数据强调了这2个标志物在CA诊断中的重要性，BIRC5和CASP9在CA患者中的表达失衡可能与疾病的发展和严重程度相关。

综上所述，BIRC5和CASP9的表达水平变化在CA的发病机制中起着重要作用，并且这些蛋白可作为诊断该疾病的潜在生物标志物。本研究为进一步研究CA的分子机制和开发新的诊断方法提供了科学依据。未来还需要进一步探讨这些生物标志物在临床实践中的应用，以及其在CA发病机制中的具体作用。